Приказ Федерального агентства по рыболовству от 04.08.2009 № 695

     Морфологические изменения   у  рыб  при  воздействии  токсических
веществ не всегда являются строго специфическими для каждого яда, чаще
всего  по  ним  можно  определить,  к  какой группе относится ядовитое
вещество.   Гистохимические   реакции   и    электрономикроскопические
исследования   более   чувствительны  и  позволяют  точнее  определить
пороговую концентрацию.

     6.2.4.10. Гематологические  и  биохимические  показатели   широко
используются    в    ихтиопатологии,    ветеринарии,    медицине,    в
токсикогигиенических  исследованиях.  Они  углубляют  представление  о
динамике интоксикации организма гораздо раньше, чем появляются внешние
признаки отравления рыб.  Определяют следующие показатели:  количество
эритроцитов   и   лейкоцитов,   эритроцитарные  картины  и  морфология
форменных  элементов  крови,  размеры  клеток  крови,   общий   белок,
активность пероксидазы (каталазы) или холинэстеразы.
     Для взятия крови рыбу завертывают  в  марлевую  салфетку.  Место,
откуда предполагают взятие крови, освобождают от слизи и избытка влаги
ватно-марлевым тампоном.  Пробы крови получают из жаберной вены  путем
введения  тонко оттянутой пастеровской пипетки в жаберный сосуд нижней
трети жаберной дужки,  а также из сердца  с  помощью  полой  иглы  или
пастеровской  пипетки.  Место  укола  в сердце лежит в середине линии,
соединяющей основание правого и левого грудных плавников.  Иглу вводят
в  сердце  под  углом 45° относительно фронтальной плоскости тела рыб.
Кровь можно также отобрать из хвостовой артерии после отрезания хвоста
или  с  помощью  полой  иглы или пастеровской пипетки,  погружая их на
медиальной линии позади анального плавника под углом 45°  до  упора  в
позвоночник рыбы. Взятая кровь быстро свертывается, поэтому необходимо
в возможно более  короткий  срок  (40-50  секунд)  взять  максимальное
количество   проб   на   определение   различных   гематологических  и
биохимических показателей.
     В качестве  антикоагулянта  применяют  гепарин  или лимоннокислый
натрий  в  виде  порошка  или  3,8%  раствора,  которым   ополаскивают
пробирки, или  добавляют  1/4  часть  раствора  к  объему  крови.  Для
определения общего  белка  антикоагулянт  не  добавляют,  а  оставляют
пробирки  с  кровью  в  теплом  месте для отделения плазмы и получения
сыворотки.
     Отбор проб     крови    и    анализ    проводят    в    следующей
последовательности:
     а) берут кровь от рыб;
     б) приготавливают мазок крови;
     в) заряжают   меланжер  для  количественного  подсчета  форменных
элементов крови или  отбирают  пробы  крови  в  пробирку  с  раствором
хлористого    натрия    для    определения    количества   эритроцитов
фотоколориметрическим методом на эритрогемометре;
     г) заряжают  гемометр Сали для определения содержания гемоглобина
крови или отбирают пробы крови для  определения  этого  показателя  на
эритрогемометре;
     д) определяют содержание гемоглобина в крови по методу  Сали  или
на эритрогемометре;
     е) подсчитывают число эритроцитов и лейкоцитов в  камере  Горяева
или на эритрогемометре;
     ж) фиксируют и окрашивают взятые мазки крови;
     з) подсчитывают количество лейкоцитов и определяют эритроцитарные
картины; - определяют общий белок сыворотки крови методом Лоури;
     и) исследуют   пероксидазную   активность   по  методу  Попова  и
Нейковска.
     Приемы и    методы    гематологических    анализов    описаны   в
соответствующих  руководствах   (Кудрявцев   А.А.,   Кудрявцев   Л.А.,
Привольнов Т.И.   Гематология    животных   и  рыб.  М:  Колос,  1969;
Балаховский С.Д.,  Балаховский И.С.  Методы химического анализа крови.
М.: Медгиз, 1953).
     Полученные результаты сводят в таблицы, подвергают статистической
обработке  и  в  соответствии с изменениями исследуемых показателей от
концентраций  вещества   устанавливают   пороговую   и   недействующую
концентрации (ЛК   и ЛК ) в хроническом эксперименте.
                16     0

     6.2.4.11. Органолептические свойства и вкусовые качества  бульона
и мяса рыб.  После вскрытия и обследования по показателям, приведенным
выше,  рыб обмывают чистой питьевой  водой,  помещают  в  стаканы  или
колбы, заливают чистой питьевой водой в соотношении 5 частей воды на 1
часть рыбы и без добавления соли варят в течение 5-10  мин  на  слабом
огне.   После   охлаждения   до   комнатной  температуры  у  сваренных
контрольных и опытных рыб вырезают кусочки спинных мышц весом  0,2-0,5
г (в зависимости от веса рыбы). Кусочки мяса помещают в рыбный бульон,
разлитый по нумерованным чашкам Петри. Порядок нумерации чашек Петри с
контрольными и подопытными рыбами оглашается дегустаторам только после
окончания  дегустации.  Для  проведения  дегустации  приглашается  3-5
человек.  Испытатели отмечают цвет бульона, присутствие или отсутствие
постороннего  запаха,  а  затем  цвет  и  присутствие  или  отсутствие
постороннего запаха мяса рыб.
     После этого определяют  вкусовые  качества  мяса  рыб  и  наличие
постороннего  привкуса.  В  норме  вкус  мяса  рыб сладковатый.  После
дегустации  образец  продукта  выбрасывают  в   банку,   полость   рта
ополаскивают питьевой водой.  Результаты дегустации испытатель вносит,
не оглашая, в таблицу по форме 8.

                                                               Форма 8

          Запись результатов органолептических исследований
----------------------------------------------------------------------
Номер пробы|   Органолептические  |     Органолептические свойства
           |    свойства бульона  |    и вкусовые качества мяса рыб
           |----------------------|-----------------------------------
           |   Цвет  |   Запах    |   Цвет  |   Запах    |    Вкус
-----------|---------|------------|---------|------------|------------
           | Изменен |Наличие или | Изменен |Наличие или |Наличие или
           | или нет |отсутствие  | или нет |отсутствие  |отсутствие
           |         |постороннего|         |постороннего|постороннего
           |         |запаха      |         |запаха      |вкуса
-----------|---------|------------|---------|------------|------------
           |         |            |         |            |
----------------------------------------------------------------------

     Обобщая дегустационные  таблицы,  испытатель  делает заключение о
наибольшей  концентрации  вещества,  которая,  по  данным  большинства
дегустаторов, не  вызывает изменений органолептических свойств бульона
и мяса, вкусовых качеств мяса рыб.

     6.2.4.12. Кумулятивные свойства  (материальная  и  функциональная
кумуляции)  химических  веществ на рыбах определяются по нижеописанной
схеме  в  соответствии  с  Методическими  указаниями   по   разработке
предельно  допустимых концентраций пестицидов в воде рыбохозяйственных
водоемов.  (Минрыбхоз  СССР  введены  в действие  от 19 января 1979 г.
N 08-3/178   "Методическими   указаниями   по   разработке   предельно
допустимых концентраций пестицидов в воде рыбохозяйственных водоемов".
Ростов-на-Дону, 1979)

     а. Оценка  накопления  вещества  в  рыбах (материальная кумуляция
вещества) проводится минимум при двух концентрациях.  Опыты ставят  по
методике  проведения  хронического эксперимента длительностью не менее
30 суток (или используют для анализа рыб из  проводимого  хронического
эксперимента).  В  течение этого периода через каждые 5 суток (5,  10,
20, 25, 30-е) отбирают особей для оценки содержания вещества в органах
и тканях опытных и контрольных рыб,  которые до окончания эксперимента
можно хранить в холодильнике.  Из 6 отобранных проб эффект  накопления
можно предварительно оценить в пробе,  отобранной на 30-е сутки.  Если
при  этом  концентрация  вещества  в  рыбе  превышает  концентрацию  в
исследуемой  воде,  проводится  анализ всех проб,  если не превышает -
аналитическое исследование остальных проб можно не проводить.
     Для количественной   оценки   материальной  кумуляции  используют
коэффициент накопления  (К ),  который  представляет  собой  отношение
                          н

максимального  содержания  вещества  в  организме  рыб  (мг/кг)  к его
концентрации в воде (мг/л).
     В зависимости от величины коэффициента  материального  накопления
(К )   вещество  по  классификации  К.К.Врочинского  (Таблица  6.2.1.)
  н

относят к соответствующей группе с коэффициентом запаса (К  ).
                                                          зн

                                                        Таблица 6.2.1.

     Классификация веществ по степени накопления их в организмах
----------------------------------------------------------------------
  Группа  |   Степень     |Коэффициент накопления |Коэффициент запаса
          |  накопления   |         (К )          |       (Кз )
          |   вещества    |           н           |          н
----------|---------------|-----------------------|-------------------
 1        |Слабая         |           50          |        1
----------|---------------|-----------------------|-------------------
 2        |Умеренная      |         51-200        |        2
----------|---------------|-----------------------|-------------------
 3        |Высокая        |        201-1000       |        4
----------|---------------|-----------------------|-------------------
 4        |Сверхвысокая   |         > 1000        |        16
----------------------------------------------------------------------

     б. Оценка  функциональной  кумуляции  вещества   проводится   для
характеристики  возможного  перехода материальной кумуляции вещества в
токсический эффект в хроническом эксперименте (накопление токсического
эффекта при воздействии вещества на организм).
     Для оценки  функциональной  кумуляции  вещества,  после   расчета
параметров  острой и хронической токсичности по каждому биологическому
объекту  (икра,  личинки,   молодь,   взрослые   рыбы),   рассчитывают
характеристику   опасности   развивающегося  токсического  эффекта  по
отношению  вероятностных  смертельных  концентраций.  Наиболее   полно
отмечаемое  явление  характеризуется  фактором  угла  наклона  "доза -
эффект" (S):

                           ЛК      ЛК
                             100     50      1
                     S = {------ + ---- } * ---,
                           ЛК      ЛК        2
                             50      0

     Оценка кумулятивного действия вещества проводится по коэффициенту
функциональной   кумуляции  (К   ),  который  определяется  отношением
                              кум

острой среднелетальной концентрации, умноженной на фактор угла "доза -
эффект",  к хронической среднелетальной  концентрации,  умноженной  на
свой фактор:
                                 остр    остр
                               ЛК     * S
                                 50
                        К    = ------------  .
                         кум       хр    хр
                               ЛК     * S
                                 50

                                                        Таблица 6.2.2.

    Оценка веществ по коэффициенту функциональной кумуляции (К   )
                                                              кум
----------------------------------------------------------------------
Степень кумуляции| Коэффициент кумуляции           |Коэффициент запаса
                 |         остр   остр    хр     хр|     (Кз   )
                 | К   = ЛК    * S    / ЛК   *  S  |        кум
                 |  кум    50             50       |
-----------------|---------------------------------|------------------
Слабая           |              1 - 50             |         1
-----------------|---------------------------------|------------------
Умеренная        |             51 - 200            |         5
-----------------|---------------------------------|------------------
Выраженная       |            201 - 1000           |         10
-----------------|---------------------------------|------------------
Высокая          |               1000              |         20
----------------------------------------------------------------------

     В зависимости от величины коэффициента  функциональной  кумуляции
вещество относят к одной из четырех групп (Таблица 6.2.2.),  каждой из
которых соответствует определенный коэффициент запаса (Кз   ).
                                                         кум

     Кумулятивные коэффициенты запаса по степени накопления вещества в
организмах (Кзн) и по степени накопления токсического эффекта (Кз   ,)
                                                                 кум

используются при расчете ПДК для пестицидов (п. 3.1.4.  Приложения 1 к
настоящим Методическим указаниям).  Коэффициент материальной кумуляции
(К )  используется  при установлении класса опасности вещества (п. 1.1
  н

Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям).

     6.2.4.13. Токсикологическая оценка исследованного  вещества.  При
токсикологической оценке вещества в качестве обязательных используются
наиболее  общие  показатели  и  признаки  отравления   рыб.   По   ним
устанавливают   максимальные   допустимые   концентрации   испытуемого
вещества,  то  есть  концентрации,  которые  в  хроническом  опыте  не
вызывают  никаких  отклонений  исследуемых  показателей  от  контроля.
Максимальные  допустимые  концентрации,   установленные   по   каждому
обязательному показателю, вносят в сводную таблицу по форме 9.

                                                               Форма 9

           Сводная таблица допустимых концентраций для рыб
----------------------------------------------------------------------
   Организмы  |   Показатели и длительность  | Максимальные допустимые
(вид, возраст)|             опыта            |   концентрации (мг/л)
--------------|------------------------------|------------------------
              |Выживаемость                  |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Прирост ихтиомассы            |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Поведение                     |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Реакции на внешние            |
              |раздражители                  |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Поедание корма                |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Характер и частота дыхания    |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Внешний вид                   |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Состояние наружных покровов   |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Состояние жаберного аппарата  |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Патологоанатомическое вскрытие|
--------------|------------------------------|------------------------
              |Состояние внутренних органов  |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Гематологические и            |
              |биохимические показатели      |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Органолептические свойства и  |
              |вкусовые качества бульона и   |
              |мяса рыб                      |
--------------|------------------------------|------------------------
              |Функциональная и материальная |
              |кумуляция                     |
----------------------------------------------------------------------

     В качестве  максимальной  допустимой  концентрации  вещества  для
взрослых   рыб  принимается  наименьшая  концентрация  из  допустимых,
установленных по каждому обязательному показателю.


     7. Оценка генотоксичности вещества

     7.1. Вводные замечания
     Генотоксичность вещества исследуется на генном,  хромосомном  или
геномном  уровне.  По  этим  данным  устанавливается  его максимальная
допустимая  концентрация  для  рыбохозяйственных  водных  объектов  по
показателю "генотоксичность".
     Для выявления мутаций на генном уровне рекомендуется тест Эймса.
     Для выявления  хромосомных аберраций в хроническом опыте проводят
следующие исследования генетического  аппарата  на  клетках  различных
тканей рыб:
     а) учет частоты хромосомных аберраций и  нарушений  митотического
аппарата  деления  клеток  эпителия  хрусталика  на  стадии  анафазы и
телофазы;
     б) учет  частоты  хромосомных  аберраций  на  стадии  метафазы на
жаберном эпителии;
     в) учет  частоты  образования  микроядер  (микроядерный  тест)  в
эритроцитах.   Оценка   генотоксичности    вещества    по    нарушению
дифференциальной активности  генов  может  проводиться  на  политенных
хромосомах из слюнных желез хирономид.

     В обязательную программу генетических исследований должно входить
изучение  генных мутаций и хромосомных аберраций одним из методов.  Вы
их выделили жирным шрифтом.  При подозрении, что вещество воздействует
на   митотическую   активность  клеток  и  обладает  канцерогенностью,
необходимо   провести   дополнительно   исследования   по    выявлению
воздействия вещества на дифференциальную активность генов.
     Исследуемые концентрации   вещества   в    эксперименте    должны
укладываться  в  диапазон  от  пороговой  концентрации  (или  ниже) до
концентрации выше значения ПДК вещества в 5 раз.

     7.2. Учет генных мутаций (тест Эймса)

     7.2.1. Характеристика тест-объекта
     Наиболее удобными,  быстрыми  и  экономичными способами выявления
мутагенной  активности  являются  методы  с  использованием  бактерий.
Широкое  применение  находит  тест-система  с  использованием бактерии
сальмонелла тифимуриум (Salmonella typhimurium) (Таблица 7.2.1.).  Эти
методы основаны на аналогичности генетических механизмов повреждения и
репарации ДНК у клеток низших и высших организмов.

                                                        Таблица 7.2.1.

          Штаммы S. typhimurium, используемые для выявления
                   мутагенной активности соединений
----------------------------------------------------------------------
Штаммы                | Основная |Дополнительные| Наличие | Выявленный
                      |  мутация |    мутации   | фактора |    тип
                      | в опероне|              |         |мутагенного
                      |          |              |         |  эффекта
----------------------|----------|--------------|---------|-----------
ТА 1950 ТА 1535 ТА 100|his G 46  | + urvB       | -       | R-BPS
                      |his G 46  | rfa urvB     | -       | R-BPS
                      |his G 46  | rfa urvB     | pKM-101 | R-BPS
----------------------|----------|--------------|---------|-----------
ТА 1534 ТА 1538 ТА 98 |his D 3052| + urvB       | -       | R-FS
                      |his D 3052| rfa urvB     | -       | R-FS
                      |his D 3052| rfa urvB     | pKM-101 | R-FS
----------------------|----------|--------------|---------|-----------
ТА 97                 |his D 6610| rfa urvB     | pKM-101 | R-FS
----------------------|----------|--------------|---------|-----------
ТА 102                |his G 428 | rfa+(PAO 1)  | pKM-101 | R-BPS
----------------------|----------|--------------|---------|-----------
А 1537                |his C 3076| rfa urvB     | -       | RPS
----------------------------------------------------------------------

Примечание: "+" - обозначение  генов  дикого  типа;  rfa  -  нарушение
липополисахаридной капсулы;  urvB  -  нарушение  системы  эксцизионной
реакции; RPS - сдвиг рамки считывания; R-BPS - замена пар оснований.

     Сущность использования системы "бактерии-микросомы" заключается в
определении способности  вещества  или  его  метаболитов  индуцировать
генные  мутации  у подопытных штаммов.  Если исследуемое вещество (или
его метаболиты)  обладают  мутагенной  активностью,  то  увеличивается
количество колоний - ревертантов на чашку Петри в опыте по сравнению с
контролем.  Под  влиянием  мутагенных  веществ  у  микроорганизмов   -
ревертантов происходят обратные мутации, и они приобретают способность
жить на среде,  лишенной гистидина или другой аминокислоты, по которой
отобран тот или другой штамм.
     Для выявления промутагенов производят  микросомальную  активацию,
после   которой  промутагены  проявляют  мутагенные  свойства.  Методы
приготовления микросомальных ферментов из гепатопан-креаса  карпа  или
других рыб приводятся ниже.
     При определении мутагенной активности  веществ,  нормируемых  для
воды  рыбохозяйственных  водных  объектов,  целесообразно использовать
микросомы именно из тканей рыб,  а не теплокровных животных,  так  как
экстраполяция  результатов,  полученных  с применением микросом печени
теплокровных  животных,  не  всегда  оправдана  при  установлении  ПДК
веществ  вследствие неадекватности протекания метаболических процессов
у различных видов животных.

     7.2.2. Проведение исследований

     7.2.2.1. Оборудование:
     бактерицидные облучатели;
     центрифуги;
     автоклавы;
     термостаты;
     размельчитель тканей;
     водяные термостатирующие бани;
     счетчик колоний;
     весы;
     сушильный шкаф;
     дистиллятор.

     Реактивы:
     K HPO , лимоннокислый натрий, NADP (Rianal);
      2   4

     KH PO , MgCl , биотин;
       2  4      2

     KCl, MgSO , L-гистидин;
              4

     (NH ) SO , БСА, нитрозогуанидин;
        4 2  4

     Na HPO , глюкозо-6-фосфат, ДМСО.
       2   4

     Мутагены:             Промутагены:
     бенз/а/пирен,         2-ацетиламинофлуоредин,
     9-аминоакридин,       2-аминофлуорен.
     Циклофосфамид;

     7.2.2.2. Приготовление   минимальной   среды   (МС).  МС  готовят
следующим  образом.  К  300 мл   расплавленного  агара  (компонент  2)
добавляют  100 мл  солевого  раствора  (компонент 1),  10 мл  20%-ного
раствора глюкозы и 2,0 мл раствора MgSO :
                                       4

     1. Компонент 1 (солевой раствор):
          лимоннокислый натрий - 2,0 г,
          K PO  * 3H O - 42,0 г,
           3  4     2

          KH PO  - 18,0 г,
            2  4

         (NH SO  - 4,0 г,
            4  4
                            3
         H O(дист.) - 1,0 дм .
          2

     2. Компонент 2 (водный агар):
         агар-20,0 г; H O - 1,0 л.
                       2

     3. 20%-ный раствор глюкозы.
     4. 1%-ный раствор MgO * 7H O.
                               2

     5. Агар для верхнего слоя:
         NaCl - 6,0 г,
         Агар - 7,0 г,

                     3
         H O - 1,0 дм .
          2

     Компоненты 1, 2, 4 и 5 автоклавируют при 0,8 атм 30 мин. Затем на
каждые 80 мл агара  добавляют 10 мл  L-гистидина  (0,5 мм)  и  биотина
(0,25 мм)  в виде стерильных растворов.  В качестве полноценной среды
(ПС) может использоваться любая среда для энтеробактерий (МПБ  и  МПА,
или АП и АПА). Она стерилизуются в автоклаве при 0,5 атм 30 мин (после
стерилизации pH = 7,0).

     7.2.2.3. Проверка генетических маркеров. Получают отдельные клоны
соответствующих штаммов. Готовят три варианта селективных сред:
     а) МС с добавкой L-гистидина;
     б) МС с добавкой биотина;
     в) МС с добавкой L-гистидина и биотина.
     Растворы аминокислоты  и биотина вносят в МС из расчета 50 мкг/мл
и  1 мкг/мл  соответственно.  Отбирают  по  25  отдельных   колоний  и
пересеивают на селективные среды, чашки Петри инкубируют при 37°C двое
суток.  По характеру роста колоний делают вывод о способности того или
иного штамма расти на среде, лишенной гистидина.

     7.2.2.4. Хранение   индикаторных   штаммов.   Суспензии   штаммов
рекомендуется хранить в диметилсульфоксиде (ДМСО)  или  глицерине  при
замораживании  (-70°C),  а  также  в  слое  0,6%  МПА  под  стерильным
вазелиновым маслом.  Периодически при пересевах  штаммы  проверяют  на
соответствие генотипу.

     7.2.2.5. Приготовление  фракций.  Фракцию  микросомных  ферментов
получают по следующей схеме:
     1. Индуцируют  синтез  микросомальных ферментов в гепатопанкреасе
карпа и белого толстолобика  ежедневными  внутрибрюшинными  инъекциями
метилхоланна из расчета 80 мг/кг веса в течение трех дней.
     2. Извлекают из животных  гепатопанкреас,  взвешивают,  промывают
стерильным раствором   0,15  M  KCl,  измельчают  и  гомогенизируют  в
трехкратном объеме 0,15 M KCl. Среда гомогенизации гепатопанкреаса рыб
дополнительно содержит 0,6%  Na-фосфатный буфер с pH 7,4. Все операции
проводят на льду.
     3. Гомогенат  центрифугируют  15  мин  при  9000 об/мин и аликвот
("фракция Sg") разливают в пластмассовые емкости объемом 3-6 мл.
     Фракцию хранят до момента использования не более двух недель (при
температуре - 80°C).

     7.2.2.6. Приготовление   микросомальной   активирующей   системы.
Фракцию Sg размораживают при комнатной температуре и ставят на лед.  В
эксперименте используют микросомальную активирующую среду,  в  1,0  мл
которой содержится фракция Sg, 5 мМ глюкозо-6-фосфат, 4 мМ NAPR, 33 мМ
KCl, 8 мМ MgCl в 0,1 М К-фосфатном буфере в pH 7,4.

     Приготовление исследуемых веществ: Готовят стандартные растворы в
дистиллированной  воде  или в растворе ДМСО (0,1;  1,0;  10,0;  100,0;
1000,0 мкг на чашку Петри).

     7.2.2.7. Приготовление бактериальной суспензии.  В  экспериментах
используют  чистую  культуру.  Для  этого  культуру  штамма  с  косяка
пересевают в 10 мл  АП  и инкубируют без аэрации 18 ч при 37°C.  Затем
19 мл  АПБ необходимо засеять 1 мл культуры и инкубировать ее при 37°C

                                                    8
на  качалке  в  течение  2-3  ч  до  плотности  5*10  кл/мл.  Культуру
центрифугируют  15  мин  при  5000  об/мин.  Осадок  ресуспендируют  в
стерильном физиологическом растворе с таким расчетом,  чтобы  получить

                         9
суспензию плотностью 2*10  кл/мл.

     7.2.3. Проведение исследований
     Чашки Петри  заливают  минимальной  средой  и   выдерживают   при
комнатной температуре 1 ч. Полужидкий полуобогащенный агар расплавляют
и помещают в термостатируемую водяную баню (46°C) на 20 мин.  В каждую
пробирку  добавляют  по  0,1 мл культуры тест-штамма,  0,2 мл раствора
исследуемого    вещества    определенной    концентрации   и    0,5 мл
микросомальной  реактивирующей  системы.  Полученную  смесь  сразу  же
перемешивают и выливают на  поверхность  чашки.  Верхний  агар  должен
покрыть  поверхность  нижнего  минимального  агара  тонким слоем.  Вся
процедура в целом занимает  не  более  20  секунд.  Затем  дают  агару
застыть  и  инкубируют  при  37°C  двое суток.  Через два дня отмечают
колонии  гистидиновых  ревертантов.  Чтобы  выяснить,   нуждается   ли
исследуемое   вещество   в   предварительной  активации,  имеет  смысл
проводить  исследования  как  в  присутствии,  так  и   в   отсутствии
микросомальной активирующей системы, содержащей фракцию Sg.
     Помимо опытных чашек должны быть и контрольные, содержащие:
     а) только культуру бактерий и растворитель;
     б) культуру бактерий,  растворитель и микросомальную активирующую
систему, содержащую фракцию Sg;
     в) культуру бактерий  с  добавлением  мутагенов  и  промутагенов,
указанных выше (п. 7.2.2.1., Реактивы):
     для штамма ТА 100 - цилофосфамида - 500 мкг на чашку;
     для   штамма  ТА 98  - бенз-а-пирена - 10 мкг,  9-аминоакридина -
10 мкг на чашку.
     В качестве  промутагенов  для штаммов ТА 98 и ТА 100 используются
2-ацетиламинофлуоредин и 2-аминофлуорен соответственно.
     Степень мутагенного  эффекта  определяют  по кратности превышения
числа колоний реверантов при данной дозе над таковым в  контроле.  При
сравнении  числа  колонии  на  опытных и контрольных чашках могут быть
получены следующие результаты, представленные в таблице 7.2.2.

                                                        Таблица 7.2.2.

                          Учет мутагенности
----------------------------------------------------------------------
Отношение числа колонии |   Характеристика мутагенности   |Обозначение
 в опыте и в контроле   |                                 |
------------------------|---------------------------------|-----------
Менее 2,5               |Отсутствие мутагенности          |   -
------------------------|---------------------------------|-----------
Менее 10                |Слабая мутагенность              |   +
------------------------|---------------------------------|-----------
10-100                  |Средняя мутагенность             |   ++
------------------------|---------------------------------|-----------
100 и более             |Сильная мутагенность             |   +++
----------------------------------------------------------------------

     Методы статистической обработки полученных результатов  приведены
в приложение 4 данных Методических указаний.

     7.3. Выявление хромосомных мутаций

     7.3.1 Определение  хромосомных  аберраций  в  эпителии хрусталика
глаза рыб

     7.3.1.1. Характеристика тест-объекта.  Исследования проводятся на
видах рыб,  у  которых  нет  резкого падения митотической активности в
осенне-зимний период.  Для исследований подходят сеголетки и  годовики
обыкновенного окуня и радужной форели.  Можно использовать другие виды
рыб,  не прекращающие активно питаться в естественных водных  объектах
зимой.  Для  морских  рыб  получены  первые результаты исследований на
покатниках семги, а также на морской камбале.

     7.3.1.2. Лабораторное оборудование и материалы:
     микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;
     микроскальпель;
     препаровальная игла с трехгранным сечением;
     препаровальная игла с тонким изогнутым концом типа "кочерги";
     обычная препаровальная игла;
     пинцет с тонкоотточенными и изогнутыми концами;
     глазные ножницы;
     гистологическая проводка от дистиллированной воды до  ксилола,  с
присутствием дополнительных стаканчиков с 30% и 50% этиловым спиртом;
     банка с притертой пробкой для фиксации препаратов глаз;
     обезвоженный медный купорос;
     этиловый спирт;
     ледяная уксусная кислота;
     краситель - гемалаун Майера либо другой  краситель  (для  ядер  и
хромосом, в зависимости от поставленной задачи).

     7.3.1.3. Проведение исследований
     а. Без  предварительной  травматизации  хрусталика  глаза.   Рыбы
выдерживаются   в   исследуемых   концентрациях  токсиканта.  Возможно
проведение  подострых  и  хронических  опытов.  После   экспозиции   в
растворах  вещества рыб забивают декапитацией.  У них извлекают глаза,
которые помещают в фиксатор из смеси  абсолютного  этанола  и  ледяной
уксусной кислоты в соотношении 3:1.  Глаза могут помещаться в марлевый
мешочек с этикеткой на дно банки с фиксатором.  Банку на 1/4 заполняют
обезвоженным медным купоросом.  Продолжительность фиксации 24 ч. После
фиксации глаза рыб обрабатываются поочередно.
     Глаза из  фиксатора  перемещают  в  дистиллированную  воду  на 20
минут. По мере обводнения они опускаются на дно стакана с водой. После
положенного  срока  поочередно  каждый  глаз  помещают  на ладонь вниз
роговицей и вверх отверстием  зрительного  нерва.  Глазными  ножницами
срезают  дно  глаза  так,  чтобы в образовавшееся отверстие мог пройти
хрусталик.  Хрусталик при  этом  становится  видимым,  но  повернут  к
препаратору  задним полюсом.  В задний полюс вводят иглу с трехгранным
сечением до упора в ядро хрусталика. Хрусталик изымается из глаза.
     Дальнейшие операции сводятся к снятию передней капсулы хрусталика
с  эпителием  и  к  получению  плоскостного  препарата  из  снятой   с
хрусталика  полусферы.  Сразу  же  после  изъятия  хрусталика из глаза
трехгранной иглой,  которая не дает возможности ему вращаться по  оси,
хрусталик  перемещают  в  каплю  дистиллированной  воды.  В этой капле
микроскальпелем по  экватору  хрусталика  делают  надрез,  и  переднюю
капсулу с эпителием помещают с волоконной частью глазной линзы в воду.
Наряду с капсулой на предметном стекле в капле  воды  могут  оказаться
фрагменты волокон хрусталика, частицы сетчатки и радужной оболочки.
     Необходимо подготовить другое предметное стекло с каплей воды,  в
которую  микропинцетом  или  обычной  препаровальной  иглой  переносят
капсулу хрусталика с эпителием.
     Далее микроскальпелем  наносятся  насечки  от  периферии к центру
полусферы капсулы хрусталика.  Обычно бывает достаточно  5-6  глубоких
насечек,  чтобы полусферическую переднюю капсулу хрусталика можно было
бы уложить в одной плоскости на  предметном  стекле.  Отдельные  части
капсулы    расправляют   препаровальной   иглой   и   "микрокочергой".
Одновременно удаляют оставшиеся на эпителии волокна хрусталика.  После
первого   расправления   вода   частично  отсасывается  фильтровальной
бумагой.
     Отдельные лепестки  капсулы  после насечек должны подворачиваться
внутрь.  Это гарантирует то, что эпителий хрусталика оказывается между
стеклом и капсулой. В этом случае плоскостной препарат приклеивается к
предметному стеклу при частичном подсушивании.
     Дальнейшие операции   сводятся   к   подсушиванию  фильтровальной
бумагой плоскостного препарата  эпителия  хрусталика  и  к  частичному
выправлению  капсулы,  она присушивается к стеклу,  но не доводится до
полного высыхания. Побелевшую, но еще влажную капсулу закрывают каплей
красителя   (при   использовании  красителя  гемалаун  Майера  процесс
окрашивания длится 5-8 мин).  При  окраске  гемалаун  Майера  препарат
помещают  в водопроводную воду,  отмывают от красителя и проявляют там
до подсинения.
     После окраски  препарата  на предметном стекле его проводят через
спирты,  доводят до ксилола и заключают  в  канадский  бальзам  или  в
другую синтетическую среду.
     Подсчет хромосомных аберраций проводят по методике,  описанной на
стадиях ана-телофазы в клетках эпителия как для всего хрусталика,  так
и  для  отдельных  зон  цитодифференцировки   эпителия:   центральной,
герминативной и предэкваториальной.  Высокая митотическая активность в
герминативной и предэкваториальной зонах позволяет более полно выявить
хромосомные мутации по сравнению с исследованием на других тканях.

     б) Исследование с предварительной травматизацией хрусталика. Рыбы
после  экспозиции  в  растворах   токсикантов   за   двое   суток   до
приготовления     препаратов    эпителия    хрусталика    подвергаются
травматизации уколом.  Укол наносят тонкой  энтомологической  иглой  в
передний  полюс  хрусталика  на  1/5  его  диаметра.  В  первые  сутки
травматизацией гасятся спонтанные  митозы  в  эпителии  хрусталика,  а
затем появляются синхронизированные посттравматические митозы,  полоса
которых повторяет  конфигурацию  травмы.  Таким  образом,  хромосомные
аберрации  на стадии ана-телофазы подсчитываются в посттравматических,
синхронизированных  митозах.  Приемы  подготовки  препаратов  эпителия
хрусталика не отличаются от вышеописанных.

     7.3.2 Определение   частоты   хромосомных   аберраций  в  клетках
жаберного эпителия рыб

     Исследования проводят   с    аквариумной    рыбой    нотобранхиус
(Nothobranchius rachovi) Метод позволяет учитывать частоту структурных
нарушений хромосом на стадии  метафазы  и  предполагает  более  полную
оценку аберраций в качественном и количественном отношениях.

     7.3.2.1. Характеристика         тест-объекта.        Нотобранхиус
(Nothobranchius rachovi)  имеет  размер 3 - 4 см,  имеет  сравнительно
небольшое  количество  хромосом  (16),  у  которой в тканях отмечается
высокая  митотическая  активность.  Рыба   легко   воспроизводится   и
достаточно неприхотлива при содержании.

     7.3.2.2. Лабораторное оборудование и материалы:
     холодильник для хранения фиксированного материала;
     микроскоп биологический,  обеспечивающий увеличение в 100-200 раз
с фотонасадкой;
     мерная посуда для приготовления растворов;
     флаконы (по 10 мл) для хранения фиксированного материала;
     вегетационные сосуды для рыб;
     предметные стекла;
     препаровальные иглы;
     пинцеты;
     скальпель;
     шприцы и иглы для инъекций;
     краситель Гимза;
     фиксатор (спирт/96%-ная ледяная уксусная кислота 3:1);
     колхицин (0,4%);
     гипотонический раствор KCl (0,4%);
     уксусная кислота (60%).

     7.3.2.3. Проведение исследований
     Для учета  средней  частоты   структурных   перестроек   хромосом
используются клетки жаберного эпителия, богатые митозами.
     Рыбе инъецируют внутримышечно 0,4%  раствор колхицина и, умертвив
ее через 5-6 часов,  отделяют жабры,  которые выдерживают в течение 20
минут в 0,4%  растворе KCl,  фиксируют в этанол-уксусной смеси (3:1) и
мацерируют  ткань  в  60%-ной  уксусной  кислоте.  Клеточную суспензию
наносят на предметные стекла, высушивают, окрашивают раствором Гимза.
     Для анализа  выбираются  метафазные  пластинки с явно выраженными
хромосомами, располагающимися в одной плоскости без наложений.
     Для каждой  рыбы  анализируют до 40 метафаз.  Независимо от числа
аберраций в одной клетке, они засчитываются как одно нарушение.
     Учитывают следующие виды нарушений:
     а) структурные хромосомные  аномалии,  включающие  хромосомные  и
хроматидные   разрывы,  фрагменты,  дицентрики,  кольцевые  хромосомы,
ацентрические фрагменты;
     б) анеуплоидные клетки;
     в) полиплоидные клетки.

     Подсчитывают на одну особь количество нормальных метафаз и клеток
с   аберрациями   хромосом,  рассчитывают  процент  нарушений  (N)  по
следующей формуле:

                    число клеток с нарушениями
          N = ------------------------------------- * 100%.
              общее число проанализированных клеток

     Вычисляют среднее арифметическое из N для каждой группы рыб.

     7.4. Учет частоты образования микроядер в эритроцитах рыб

     Метод позволяет учитывать в цитоплазме  эритроцитов  рыб  частоту
образования  микроядер,  которые представляют собой фрагменты ядерного
материала,   элимининирующиеся   из   ядра   клетки   при   аберрациях
митотических хромосом.

     7.4.1. Проведение исследований

     7.4.1.1. Оборудование и материалы:
     микроскоп биологический,  обеспечивающий увеличение в 100-200 раз
с фотокамерой;
     мерная посуда для приготовления растворов;
     предметные стекла;
     вегетационные сосуды для рыб;
     краситель Гимза;
     этиловый спирт (96%) для фиксации.

     7.4.1.2. Подготовка мазков крови
     Для приготовления  мазков  кровь  берут из хвостовой вены.  Мазки
фиксируют в чистом этаноле,  высушивают,  окрашивают 10%-ным раствором
красителя Гимза и просматривают под микроскопом.

     7.4.1.3. Учет и анализ результатов
     Анализу подлежат  мазки,  где  клетки  располагаются  равномерно,
образуя  монослой без наложений и повреждений цитоплазмы.  Учитываются
только целые эритроциты.
     Для определения  частоты  встречаемости  клеток с одним или двумя
микроядрами анализируют 1000 эритроцитов  на  особь  на  1  предметное
стекло. Перед подсчетом стекла можно шифровать.

     7.5. Микроядерный тест на эпителии гуппи

     7.5.1. Характеристика тест-объекта
     С целью  выявления  тест-реакции  на  индукцию  микроядер   можно
использовать покровный эпителий гуппи.
     Применение метода обосновано тем,  что во  время  деления  клеток
ацентрические  фрагменты  хромосом  и  отставшие хромосомы не входят в
дочерние ядра, а формируют в цитоплазме одно и реже два ДНК-содержащих
образования,  получивших  название  микроядра.  Микроядра представляют
собой округлые  образования  в  цитоплазме,  имеющие  темную  окраску,
сходную   с   окраской  ядер  исследуемых  клеток.  Размеры  микроядер
изменяются от 1/5 до 1/20 размера ядра.

     7.5.2. Оборудование и материалы:
     аквариумы емкостью 5 л;
     микрокомпрессоры;
     микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;
     чашки Петри;
     покровные и предметные стекла, пипетки объемом 1-5 мл;
     препаровальные иглы;
     микроскальпели;
     глазные пинцеты;
     счетчик для подсчета форменных элементов крови.

     7.5.3. Проведение исследований
     Для выявления микроядер используют те  же  методики,  что  и  для
выявления хромосомных  аберраций  (п. 7.3.1  Раздела 7).  В препаратах
определяют количество клеток с  микроядрами  на  1  тыс.  подсчитанных
клеток и выражают их число в процентах.
     При этом учитывают на временно  окрашенных  препаратах  появление
микроядер в клетках эпителия в опыте и контроле.

     7.5.4. Учет и анализ результатов
     Критерием генотоксичности   вещества    является    статистически
достоверное  увеличение  числа клеток,  содержащих микроядра в опытных
препаратах по сравнению с контролем.

     7.6. Определение  генотоксичности   вещества   по   действию   на
дифференциальную активность генов

     7.6.1. Характеристика тест-объекта
     Исследования проводятся  на  политенных  хромосомах   в   слюнных
железах  предкуколки хирономид.  В качестве тест-объекта рекомендуется
лабораторная культура хирономид - хирономус тами и хирономус  плумозус
(Chironomus  thummi  и  Ch.  Plumosus).  При  исследовании  вещества в
соленой  воде  в  качестве  тест-объекта  рекомендуется   лабораторная
культура    хирономид    (Chironomus   sp.)   из   азовских   лиманов,
адаптированная  к  солености  20%о.  В  результате  проведения  работы
выявляется  действие  веществ  на  структуру интерфазных хромосом и на
дифференциальную активность проявления пуффинга в процессе метаморфоза
личинки в куколку.

     7.6.2. Оборудование и материалы:
     микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;
     тонкий пинцет;
     препаровальные иглы;
     предметные и покровные стекла;
     кисточка;
     фильтровальная бумага;
     краситель ацетоарсеин (0,5% арсеина в 45%-ной уксусной кислоте);
     среда для  заливки  (краситель,  разведенный  в  соотношении  1:3
45%-ной уксусной кислотой);

     7.6.3. Проведение исследований
     Определение генотоксичности  химических  соединений и их действия
на дифференциальную активность генов проводят на предкуколке, развитие
которой  наблюдается  с  36-го  по  38-й день при температуре 20-25°C.
Стадия  предкуколки  характеризуется  набуханием  грудных   сегментов,
укорочением и заострением тела и уменьшением ложных ножек.  Метаморфоз
проходит в 6-й,  7-й, 8-й и 9-й фазах развития. Изменение цвета тела с
красного на темно-серый указывает на окончание метаморфоза.
     Для синхронизации развития  и  отбора  хирономид  в  эксперименте
заранее следят за степенью потемнения головы на первой фазе четвертого
возраста,  перед тем как личинка перейдет в фазу предкуколки. Отбирают
личинок, у которых красный цвет головы меняется на темно-коричневый, и
затем ждут момента набухания грудных сегментов  и  укорачивания  тела.
Препараты  политенных  хромосом  из  слюнных  желез получают следующим
образом.  Личинку помещают на фильтровальную бумагу  для  обсушивания,
затем переносят на предметное стекло,  тонко отточенным пинцетом берут
за мандибулы и  тянут,  отрывая  голову.  Вместе  с  головой  из  тела
вытягивается   кишечник,  по  бокам  которого  видны  слюнные  железы,
прикрепленные  к  голове  протоками.  Препаровальными  иглами  слюнные
железы  отделяют  от  остальных тканей и окрашивают их в течение 10-15
мин  ацетоорсеином.  После  окрашивания  слюнные  железы  изымают   из
красителя и помещают на чистое предметное стекло.  На покровное стекло
наносится капля среды для  заливки.  Покровное  стекло  переворачивают
так,  чтобы капля покрыла слюнные железы. На покровное стекло помещают
кусочек  фильтровальной  бумаги  и  большим  пальцем,  без  сдвигов  в
стороны, клетки   слюнных   желез  раздавливают.  Среда  для  заливки,
выступившая из под покровного  стекла,  впитывается  в  фильтровальную
бумагу.  Затем  бумагу  удаляют,  а  края  покровного стекла смазывают
бесцветным лаком. Благодаря лаку, препарат предохраняют от высыхания.

     7.6.4. Учет и анализ результатов
     Генотоксичность вещества   оценивается   по  нарушению  структуры
политенных хромосом (возможны разрывы,  распад концов и дезинтеграция)
и  по  нарушению  пуфинга  во время метаморфоза.  Отмечается следующее
образование пуфов в норме. На первой хромосоме пуф Gih-к увеличивается
в  размерах  на  7-й  и  8-й фазах развития.  На второй хромосоме 2Азв
постепенно сужается,  а пуф 2Азе увеличивается на  каждой  последующей
фазе.  На  8-й  фазе  появляются  2  пуфа 2Д2де и пуф 2Г2.  На третьей
хромосоме на 6-й и 7-й  фазах  имеется  пуф  3Дih, а  после  7-й  фазы
появляется пуф  3Дif,  который  отмечается  до  конца метаморфоза.  На
четвертой   хромосоме   видны   тельца   Бальбиани,   которые    резко
увеличиваются на 8-й фазе.  Помимо этого на 6-й фазе появляется быстро
исчезающий пуф 4Дс.
     При действии  некоторых токсикантов у личинок насекомых,  имеющих
политенные хромосомы, может возникнуть до 22 новых пуфов.


     8. Определение требований к оценке временных нормативов  вещества
        для пресноводных водных объектов

     8.1. Расчетный метод оценки ОБУВ органических пестицидов
     Для вычисления  величин  ОБУВ  пестицидов  органического  состава
необходимо   обычным    порядком  (п. 7   Приложения 2   к   настоящим
Методическим указаниям) установить следующие величины:
     X  - коэффициент распределения "октанол-вода" - K  ;
      1                                               ow

     X  - для дафний - ЛК   за 48 ч (мг/л);
      2                  50

     X  - для взрослых или годовиков рыб - ЛК   за 96 ч (мг/л);
      3                                      50

     X  - для личинок рыб - ЛК   за 48 ч (мг/л).
      4                       50

     Полученные величины вставляются в следующее обобщающее уравнение:

      lgОБУВ = A + b  * lgX  + b  * lgX  + b  * lgX  + b  * lgX
                    1      1    2      2    3      3    4      4

     Коэффициенты A,  b ,  b ,  b  и b  выбираются из таблицы 8.1.1. в
                       1    2    3    4

соответствие  с  имеющимся  максимальным  набором  известных  исходных
показателей (предикторов).  Если какие-либо предикторы неизвестны,  то
из общего уравнения исключают соответствующие члены.
     Для пестицидов, обладающих  высокой  токсичностью,  имеющих  ЛК
                                                                    50
менее 0,1 мг/л, рекомендуется вычислять уравнение и с другой подборкой
коэффициентов (Таблица 8.1.2.).
     Из двух вариантов следует выбрать меньшее количественное значение
ОБУВ вещества.

     8.1.1. Примеры расчета ОБУВ
     1. Пример расчета ОБУВ среднетоксичного пестицида (ридомила):
     а) полный набор
        lgK   = 1,65 (f ) ПДК = 0,01 мг/л,
           ow          1

        ЛК   для дафний = 0,6 (X ),
          50                    2

        ЛК   для рыб = 91,8 (X ),
          50                  3

        ЛК   для личинок = 34,3 (X );
          50                      4

     проводим логарифмирование:
        f  = lgX  = -0,22,
         2      2

        f  = lgX  =  1,96,
         3      3

        f  = lgX  =  1,54;
         4      4

     находим по таблице 8.1.1. для набора X  X  X  X :
                                           1  2  3  4

       A = -3,35; b  = -0,11; b  = 0,10; b  = 0,43; b  = 0,31;
                   1           2          3          4

     подставляем в уравнение:

     lgY = -3,3 5 + (-0,11) * 1,65 + 0,10 * (-0,22) + 0,43 * 1,96 +
+ 0,31 * 1,54 = -3,35 - 0,18 - 0,02 + 0,84 + 0,48 = -2,23,

           -2,23
     Y = 10      = 0,006 ОБУВ = 0,006 мг/л;

                                                        Таблица 8.1.1.

                Коэффициенты формулы для расчета ОБУВ
       при разных вариантах исходной информации (общий случай)
----------------------------------------------------------------------
 Набор установленных |                  Коэффициенты
    предикторов      |------------------------------------------------
                     |    A    |   b    |    b    |    b    |   b
                     |         |    1   |     2   |     3   |    4
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -2,05   | -0,42  |    -    |    -    |   -
 1                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -3,23   |   -    |   0,89  |    -    |   -
 2                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -3,90   |   -    |    -    |   0,91  |   -
 3                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -3,55   |   -    |    -    |    -    |  0,90
 4                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -2,62   | -0,22  |   0,57  |    -    |   -
 1  2                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -3,42   | -0,12  |    -    |   0,74  |   -
 1  3                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -2,87   | -0,19  |    -    |    -    |  0,69
 1  4                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -3,76   |   -    |   0,32  |   0,68  |   -
 2  3                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -3,48   |   -    |   0,37  |    -    |  0,62
 2  4                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -3,82   |   -    |    -    |   0,63  |  0,32
 3  4                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -3,50   | -0,08  |   0,18  |   0,66  |   -
 1  2  3             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -2,95   | -0,16  |   0,12  |    -    |  0,63
 1  2  4             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -3,29   | -0,13  |    -    |   0,44  |  0,35
 1  3  4             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -3,72   |   -    |   0,27  |   0,54  |  0,19
 2  3  4             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X  X           | -3,35   |  -0,11 |   0,10  |   0,43  |  0,31
 1  2  3  4          |         |        |         |         |
----------------------------------------------------------------------

                                                        Таблица 8.1.2.

                Коэффициенты формулы для расчета ОБУВ
               при разных вариантах исходной информации
           (для высокотоксичных препаратов, ПК  < 0,1 мг/л)
                                              50
----------------------------------------------------------------------
 Набор установленных |                  Коэффициенты
    предикторов      |------------------------------------------------
                     |    A    |   b    |    b    |    b    |   b
                     |         |    1   |     2   |     3   |    4
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -2,05   | -0,42  |    -    |    -    |   -
 1                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -3,13   |   -    |   0,96  |    -    |   -
 2                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -4,28   |   -    |    -    |   0,73  |   -
 3                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X                    | -2,97   |   -    |    -    |    -    |  1,21
 4                   |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -2,61   | -0,30  |   0,29  |    -    |   -
 1  2                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -2,86   | -0,28  |    -    |   0,57  |   -
 1  3                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -2,23   | -0,27  |    -    |    -    |  0,82
 1  4                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -3,22   |   -    |   0,56  |   0,78  |
 2  3                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -2,17   |   -    |   0,68  |    -    |  1,13
 2  4                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X                 | -3,32   |   -    |    -    |   0,25  |  0,99
 3  4                |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -2,13   | -0,24  |   0,16  |    -    |  0,85
 1  2  3             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -2,50   | -0,24  |    -    |   0,28  |  0,61
 1  3  4             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -2,44   |   -    |   0,51  |   0,33  |  0,91
 2  3  4             |         |        |         |         |
---------------------|---------|--------|---------|---------|---------
X  X  X              | -3,72   |   -    |   0,27  |   0,54  |  0,19
 2  3  4             |         |        |         |         |
----------------------------------------------------------------------

     б) пусть  неизвестны lgK   и ЛК   для  личинок. Тогда  используем
                             ow     50
набор X  X :
       2  3

A = -3,76; b  = 0,32; b  = 0,68, который подставляем в уравнение:
            2          3

lgY = -3 76 + 0,32 * (-0,22)+ 0,68 * 1,96 = -3,76 - 0,07 + 1,33 = -2,5

           -2.5
     Y = 10     = 0,003 ОБУВ = 0,003 мг/л.

     2. Пример расчета ОБУВ высокотоксичного пестицида (карате):
     а) по таблице 8.1.2:
     пусть неизвестен lgK  . Тогда используем набор X  X  X  :
                         ow                          2  3  4

     ЛК   для дафний - 0,00059 (X ), ПДК - 0,00000002 мг/л,
       50                        2

     ЛК   для рыб - 0,005 (X ),
       50                   3

     ЛК   для личинок = 0,0034 (X );
       50                        4

     проводим логарифмирование:
     f  = lgX  = -3,23,
      2      2

     f  = lgX  = -2.3,
      3      3

     f  = lgX  = -2,47;
      4      4

     находим по таблице 8.1.1. для набора X  X  X  :
                                           2  3  4

     A = -3,72; b  = 0,27; b  = 0,54, b  = 0,19;
                 2          3          4

     подставляем в уравнение

     lgY = -3,72 + 0,27 * (-3,23) + 0,54 * (-2,3) + 0,19 * (-2,47) =
= -3,72 - 0,87 - 1,24 - 0,47 = - 6,3
           -6.3
     Y - 10    = 0,0000005 ОБУВ - 0, 0000005 мг/л;

     б) по таблице 8.1.2:
     пусть неизвестен lgK  . Тогда используем набор X  X  X  :
                         ow                          2  3  4

     ЛК   для дафний - 0,00059 (X ), ПДК - 0,00000002 мг/л,
       50                        2

     ЛК   для рыб - 0,005 (X ),
       50                   3

     ЛК   для личинок = 0,0034 (X );
       50                        4

     проводим логарифмирование:
     f  = lgX  = -3,23,
      2      2

     f  = lgX  = -2,3,
      3      3

     f  = lgX  = -2,47;
      4      4

     находим по таблице 8.1.2. для набора X  X  X  :
                                           2  3  4

     A = -2,44; b  = 0,51; b  = 0,33, b  = 0,91;
                 2          3          4

     подставляем в уравнение

     lgY = -2,44 + 0,51 * (-3,23) + 0,33 * (-2,3) + 0,91 * (-2,47) =
= -2,44 - 1,65 - 0,76 - 2,25 = - 7,1
           -7.1
     Y - 10    = 0,00000008 ОБУВ = 0,00000008 мг/л.
     По таблице  8.1.1.  получено  меньшее значение,  его и выбираем в
качестве ОБУВ пестицида карате.

     8.2. Определение  требований  по  оценке  ОБУВ  веществ,   помимо
органических пестицидов

     Помимо ОБУВ   органических   пестицидов,  в  пресноводных  водных
объектах устанавливаются в краткосрочных исследованиях исходные данные
для оценки ОБУВ веществ:
     а) ядохимикатов сельскохозяйственного и промышленного  назначения
неорганического состава;
     б) соединений  и  их  смесей,  используемых  в   газо-,   нефте-,
горно-добывающих, перерабатывающих и других отраслях промышленности;
     в) химических средств обработки воды;
     г) веществ,  планируемых к широкому использованию в строительстве
и транспорте.

     8.2.1. Исследования на водорослях

     Целесообразно проведение   7-суточных    исследований    действия
вещества на рост культуры водорослей (п.  1.4 Приложения 1 к настоящим
Методическим указаниям).  В  качестве  альтернативы  возможно   полное
проведение  хронического  эксперимента  с одноклеточными водорослями в
течение 14 суток.
     В конце    опытов    оценивается   статистическая   достоверность
отклонений опытных данных от контрольных.
     Условия культивирования водорослей и постановки токсикологических
исследований  с  ними приведены  в  п.п. 1.3.  и  1.4  Приложения 2  к
настоящим Методическим указаниям.

     8.2.2. Исследование на зоопланктонных организмах

     Исследования проводятся  на  односуточных дафниях около 20 суток,
что определяется временем появления трех пометов у контрольных дафний,
или  на односуточных цериодафниях в течении 7-8 суток,  когда у рачков
появляется 3-й помет.
     Постановка токсикологических исследований изложена в  п.п. 4.1.4.
и 4.2.3. Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям.

     8.2.3 Исследования на эмбрионах и личинках рыб

     8.2.3.1. Проведение исследований
     Условия содержания    рыб,   получения   икринок   и   проведения
исследований  на  них  приведены  в  п.  6  Приложения   2   настоящих
Методических указаний.

     8.2.3.2. Анализ результатов исследований
     В качестве максимальной допустимой концентрации вещества для  рыб
принимается  максимальная  концентрация,  не  вызывающая статистически
достоверного повышения смертности эмбрионов и личинок.

     8.2.4 Исследования изменений санитарных показателей водной среды

     8.2.4.1. Проведение исследований
     Исследуемое вещество  оценивают  по  изменению  показателя  БПК ,
                                                                    5
характеризующего процессы самоочищения водной среды.
     Исследования  проводятся  при 20°C  в стеклянных сосудах  объемом
    3
5 дм ,  заполняемых природной морской  водой,  профильтрованной  через
мельничный газ N 16 и насыщенной кислородом.
     В сосуды  вносится  исследуемое  вещество  в  5-7  концентрациях,
различающихся   на   порядок.   Один  из  сосудов  остается  чистым  и
используется в качестве контроля.  В исходные сутки,  а также через  5
суток  в  пикнометры  отбираются пробы воды (по 2 пикнометра на каждую
пробу), которые выдерживаются в термостате при 20°C в течение 5 суток.
     Через 5  суток  после  экспозиции  в каждом из пикнометров в воде
определяют  содержание  кислорода  по  Винклеру  или   с   применением
специально приспособленных оксиметров.
     Расчет величины БПК  производится следующим образом:
                        5

                         БПК  = [O ]   - [O ]
                            5     2 исх    2 t

    где: [O ]    - исходная концентрация кислорода в воде,
           2 исх

         [O ] - концентрация кислорода в пробах на 5 сутки наблюдения.
           2 t

     Результаты используются  для  составления  таблицы  или  графиков
зависимости БПК  от времени и концентрации исследуемого вещества.
               5

     8.2.4.2. Анализ результатов исследования
     Оценка эффекта химического  вещества  производится  по  сравнению
величин БПК  в опыте и в контроле:
           5

                      БПК (оп) - БПК (контр)
                         5          5
                 N = ----------------------- * 100%,
                             БПК (контр)
                                5

     где: БПК (оп) и БПК (контр), соответственно, в опыте и в контроле
             5          5
на один и тот же срок.
     Безвредной для   процесса   самоочищения  следует  считать  такую
концентрацию, при    которой    показатель    БПК    отклоняется    от
                                                 5
соответствующих   значений   в    контроле   не   более  чем  на  20 %
(т.е. N < 20%).
     Для вычисления концентрации,  вызывающей 20 %  отклонение,  путем
интерполяции может быть использовано следующее уравнение:

                              20 - N
                                    1
                   C = C  + ----------- * (C - C ),
                        1      N  - N       2   1
                                2    1

     где: C  -  концентрация вещества,  вызывающая отклонение значений
БПК  от аналогичных значений в контроле на 20%; С  и С  - концентрации
   5                                             1    2

вещества,  вызвавшие    отклонения   БПК  менее  и  более  чем  на 20%
                                        5

соответственно; N  и N  - величины этих отклонений.
                 1    2

     Определение величины временного норматива.

     Из концентраций,  выведенных  в  процессе исследований в качестве
максимальных  допустимых  для  каждого   из   объектов   исследования,
выбирается наименьшая, которая и рассматривается в качестве временного
норматива вещества - ориентировочного безопасного  уровня  воздействия
(ОБУВ вещества).




                                                          Приложение 3
                                           к  Методическим   указаниям
                                           по  разработке   нормативов
                                           качества    воды     водных
                                           объектов рыбохозяйственного
                                           значения,   в   том   числе
                                           нормативов        предельно
                                           допустимых     концентраций
                                           вредных  веществ  в   водах
                                           водных             объектов
                                           рыбохозяйственного значения


Требования к разработке максимальных допустимых концентраций вещества
               для морских биологических тест-объектов


     1. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для
одноклеточных водорослей

     1.1. Введение

     Оценка влияния веществ на одноклеточные водоросли  осуществляется
по нижеследующим показателям:
     а) изменение  численности  клеток  водорослей   при   воздействии
веществ, содержащихся в тестируемой воде, по сравнению с контролем;
     б) характер  изменения  численности  клеток:  их  увеличение  или
снижение,   отражающее  интенсивность  деления  клеток  водорослей  по
отношению к контролю.
     Критерием токсичности   раствора  вещества  является  достоверное
снижение численности клеток водорослей ("выживаемость") в растворе  по
сравнению с контролем.
     Критерием эвтрофирующего эффекта  вещества  является  достоверное
увеличение  численности  клеток  водорослей  в различных концентрациях
вещества. Лимитирующий показатель вредности вещества в данном случае -
экологический.  Наряду с изучением динамики численности водорослей,  к
регистрируемым показателям в  опыте  следует  относить  изменение  pH;
визуальные  наблюдения за состоянием культуры водорослей:  изменения в
окраске,  форме клеток и состоянии суспензии (взвешенное, опускание на
дно,   всплывание   к  поверхности,  гомогенность  или  агрегация)  по
сравнению с контролем.
      В качестве  экспресс-метода  оценки  токсичности  вещества можно
использовать  приборный  метод  быстрой  или замедленной флуоресценции
водорослей   (Минрыбхозом   СССР   введены   в  действие  методические
разработки   ВНИРО  от  18  декабря  1987  г.  N  291-ц  "Методические
рекомендации  по  экспрессному биотестированию природных и сточных вод
с  использованием замедленной флуоресценции одноклеточных водорослей".
М.:  ВНИРО,  1987).  Показания  изменения  флуоресценции  водорослей в
растворах   вещества  по  отношению  к  контролю  следует  относить  к
основным   показателям,   характеризующим  процессы  жизнедеятельности
одноклеточных    водорослей.    Показания    быстрой   и   замедленной
флуоресценции    относятся    только   к   живым   клеткам,   отражают
интенсивность   процесса   фотосинтеза  водорослей,  по  калибровочной
кривой позволяют определить количество живых клеток в эксперименте.
       Кратковременная  оценка  токсичности   раствора   вещества - до
24-96 ч  -  позволяет определить наличие острого токсического действия
вещества на одноклеточные водоросли,  а длительное исследование  -  до
14-21 суток - его хроническое токсическое действие.
     К дополнительным показателям при исследовании  следует  относить:
оценку  биомассы  водорослей  (полученную  расчетным методом),  оценку
скорости  и  темпа  деления  клеток  (расчет  генераций),   содержание
фотосинтезирующих  пигментов (хлорофилла и каротиноидов),  соотношение
живых и мертвых клеток водорослей (используя люминисцентный  микроскоп
или различные витальные красители - цитохимический метод).

     1.2. Характеристика тест-объектов

     В качестве   основного  стандартного  тест-объекта  рекомендуется
использовать  лабораторную   монокультуру   одноклеточных   золотистых
водорослей  феодактилум  трикорнутум (Phaeodactylum tricornutum).  Вид
представлен клетками овально-треугольной формы с  шипиками  на концах.
Клетки неподвижны,  длина 13-16 мкм.  Размножение вегетативное,  путем
простого деления клеток надвое.  Численность клеток  увеличивается  за
трое  суток  не  менее чем в 3 раза.  После пересева культуры на новую
среду,  экспоненциальная фаза роста наступает на 4 сутки.  Данный  вид
водорослей используется в международном стандарте оценки качества воды
(ИСО 10253:  2006 Качество  воды.  Тест  по  угнетению  роста  морских
водорослей Skeletonema costatum и Phaeodactylum tricornutum).
     В исключительных случаях или в качестве  дополнительной  культуры
возможно   использовать   другой  вид  водорослей  из  перидиниевых  -
экзувиелла  кордата  (Exuviella  cordata)  или   пророцентрум   миканс
(Prorocentrum   micans),   с   указанием   срока   выхода  культуры  в
экспоненциальную  фазу  роста  в  культуре,  темпа  деления  клеток  и
диапазона  чувствительности  водорослей  к  стандартному  (эталонному)
веществу бихромату калия (п. 1.4.  Приложения 2 настоящих Методических
указаний).

     1.3. Условия лабораторного содержания одноклеточных водорослей
     Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и
реактивы, в том числе:
     климатостат (люминостат) любого типа, оснащенный лампами дневного
     света  3000 - 6000 лк,  обеспечивающий   поддержание  температуры
(20 +/- 2)°С;
     прибор для определения солености воды;
     pH-метр;
     оксиметр   любого  типа  с   погрешностью   измерения  не   более
         3
0,5 мг/дм ;
     спиртовка;
     микроскоп биологический обеспечивающий увеличение в 100-200 раз;
     камера счетная Нажотта (или камера Горяева);
     предметные и покровные стекла;
     фильтровальная установка любого типа;
     фильтры мембранные (размер пор 3,5 мкм; 0,45 мкм);
     пипетки автоматические-дозаторы на 0,1-0,2 см ;
     готовая искусственная морская соль;
     двухромовокислый калий К Cr О  марки "хч" или стандарт-титр калия
                             2  2 7
     двухромовокислого;
                                                                   3
     стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 100, 500, 1000 см ;
                                                    3
     колбы конические на 100, 150, 250, 500, 1000 см ;
     культура морских    одноклеточных    водорослей     Phaeodactylum
     tricrnutum Bohlin;
     Выращивают водоросли (Таблица 1.3.1.) на среде Гольдберга.

                                                        Таблица 1.3.1.

                 Состав питательной среды Гольдберга
----------------------------------------------------------------------
N исходного|    Реактив   | Навеска реактива|               3
 раствора  |              |           3     | Количество (см ) каждого
           |              |   г/100 см      | исходного раствора на
           |              |дистиллированной |     3
           |              |      воды       | 1 дм  морской природной
           |              |                 | воды
-----------|--------------|-----------------|-------------------------
    1      | KNO          |     10,1        |            2
           |    3         |                 |
-----------|--------------|-----------------|-------------------------
    2      | NaH PO       |     1,421       |            0,5
           |    2  4      |                 |
-----------|--------------|-----------------|-------------------------
    3      | MnCl  4H O   |     0,01979     |            1
           |     2   2    |                 |
           |              |                 |
           | CoCl  6H O   |     0,02379     |
           |     2   2    |                 |
-----------|--------------|-----------------|-------------------------
    4      | FeCl  6H O   |     0,02703     |            1
           |     3   2    |                 |
----------------------------------------------------------------------

     Питательную среду для культивирования  готовят  на  искусственной
морской воде или на морской природной воде (черноморской, беломорской,
балтийской,  каспийской и т.д.),  которую  предварительно  отбирают  в
незагрязненном районе.  Морскую воду фильтруют через мембранный фильтр
(размер пор 3,5 мкм).  Дважды  стерилизуют,  нагревая  до  температуры
75-80°C  и  охлаждая до комнатной температуры.  В подготовленную таким
образом морскую воду добавляют растворы N 1,  N 2 и N 3  (см.  таблицу
1.3.1).  Затем  среду  стерилизуют  третий раз,  охлаждают и добавляют
раствор N 4.
     Приготовленную вышеописанным способом среду хранят в темном месте
при комнатной температуре.  Исходные растворы для приготовления  среды
хранят в холодильнике, в случае помутнения производят их замену.

     Культивируют водоросли  в  конических  колбах  объемом 250-300 мл
закрытых  фольгой  или  ватно-марлевой  пробкой  в   люминостате   или
климатостате,  избегая попадания прямых солнечных лучей.  Освещенность
3000-6000 люкс.  Лампы дневного света размещают на расстоянии 30-40 см
от   поверхности   культуры.   Соблюдается   световой  суточный  ритм.
Температура при  культивировании  водорослей  20  +/-  2°C.   Культуру
водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1-2 раза в сутки.

     Водоросли рекомендуется  один  раз в десять дней пересевать.  Для
                                                           3
этого  в  чистую простерилизованную  колбу  объемом  250 см  со свежей
средой  (100-150 мл)   над  пламенем  спиртовки   приливают   примерно
        3
15-20 см  верхнего  росткового  слоя  из  колбы  ранее  культивируемых
водорослей.  При  этом получают начальную плотность клеток в колбе для
                                               3
культивирования,    примерно    300  тыс. кл/см .    Колбу   закрывают
ватно-марлевым и пробками или  фольгой,  перемешивают,  записывают  на
колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат.
     В течение дня содержимое колбы следует перемешивать 1-2 раза.

     1.4. Проведение исследований
     Опыты проводят  при  оптимальной  температуре и освещении,  как и
культивирование   водорослей   (п. 1.3.   Приложения  3).   Используют
водоросли   в   экспоненциальной   фазе   роста,   что   соответствует
трехсуточной культуре водорослей после пересева.  Плотность культуры в
колбе в это время достигает примерно 5 млн. кл/мл.
                                                                3
     В опыте используют начальную плотность клеток 25 тыс. кл/см . Для
этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом,  исходя из
                                                                 3
объема   исследуемой  концентрации  вещества  (например,  100  см )  и
численности  клеток  в  культуре   в   экспоненциальной   фазе   роста
              3
(5 млн.  кл/см ).  В указанном случае в опытную  и  контрольную  среду
                     3
добавляется по 0,5 см  трехсуточной культуры водорослей.
     Периодически (не  реже  1  раза  в  месяц)  необходимо  проводить
контроль  физиологической  чувствительности  водорослей.   Для   этого
используют  эталонное  химическое  вещество  -  двухромовокислый калий
K Cr2 О марки "хч"  или стандарт-титр калия двухром окислого.  Готовят
 2  2  7
                                                             3
маточный раствор двухромовокислого калия концентрацией 1 г/ м .  Далее
методом разбавления готовят серию растворов с концентрациями 1,0; 2,5;
                         3
5,0;  7,5  и  10,0  мг/дм .  Исследование проводят в течение 96 ч.  На
основании полученных  результатов  рассчитывают  среднюю  концентрацию
К Cr О , вызывающую уменьшение численности клеток на 50% за 96 ч (ЛК
 2  2 7                                                             50

за 96 ч). Если полученное значение ЛК   находится в интервале 5,8-10,0
                                     50
     3
мг/дм ,   то   культура   водорослей   может   быть  использована  для
экспериментов.
     Если полученные значения ЛК   не  попадают  в  интервал  5,8-10,0
                                50

     3
мг/дм ,  то  эксперименты с водорослями не проводят,  выясняют причину
(условия культивирования, состав культуральной среды и прочее). Иногда
культуру водорослей заменяют и проводят эксперименты заново.

     При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и

                             3                   3
опытные колбы емкостью 250 см  наливают по 100 см  (в  колбы  емкостью

      3                        3
100 см   наливают   по   50  см )  контрольной  среды   и  исследуемые
концентрации вещества.  Контролем служит среда Гольдберга. Исследуемые
концентрации веществ также готовят на среде Гольдберга.
                                                                     3
     Затем в опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 см 

        3
(0,25 см ) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста.
     Колбы закрывают  ватно-марлевыми   пробками   или   фольгой,   их
содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную
численность клеток,  которая должна  составлять  25 тыс. кл/мл.  Колбы
помещают в люминостат (или в климатостат) и экспонируют в течение трех
суток (острый) или четырнадцати суток (хронический) эксперимент.

     В эксперименте должно быть исследовано не  менее  5  концентраций
вещества. Повторность трехкратная.

     Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа:  предварительный
и основной (окончательный).
     В предварительном  остром эксперименте находят интервал токсичных
концентраций.  Опыты  проводят  в   широком   диапазоне   концентраций
вещества,  которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент
10).  Например,  0,01;  0,1;  1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее
пяти  концентраций  в  двух повторностях.  По результатам эксперимента
определяется   диапазон   концентраций   для   основного   острого   и
хронического эксперимента.

     В основном   остром   и   хроническом   эксперименте   шаг  между
концентрациями  различается  в  2-5  раз.  Исследуют  не  менее   пяти
концентраций в трех повторностях.

     Подсчет клеток  водорослей  проводят в остром опыте ежедневно,  в
хроническом на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки.
     На  14  сутки   от   начала   эксперимента   опыт   прекращают  и
устанавливают,  оказывают   ли   исследуемые   концентрации   вещества
хроническое токсическое (или эвтрофируюшее) действие на водоросли.

     1.5. Учет и анализ результатов
     Для подсчета  численности  клеток  под   микроскопом   используют
                                      3
счетную камеру Нажотта объемом 0,01 см  (или камеру Горяева).

     Подсчет клеток в камере Нажотта осуществляют  следующим  образом.
Камеру  Нажотта  и  покровное  стекло  толщиной  0,2-0,4 мм  промывают
дистиллированной водой и вытирают насухо.  Из каждой  контрольной  или
опытной  колбы  каплю суспензии водорослей наносят на середину камеры,
покровное стекло плотно прижимают к поверхности камеры  (в  камере  не
должно  быть  пузырьков воздуха),  дают отстояться  1-2 минуты,  после
чего начинают подсчет в пяти  правых  верхних  и  пяти  правых  нижних
вертикальных счетных полосах.  Затем выводят среднее количество клеток
в одной полосе.  При большом разбросе клеток в полосах просчитывают 10
верхних  и  10  нижних полос.  Полученное среднее число клеток в одной
полосе умножают на коэффициент 1600 и величину  разведения  (например,
при  разведении  культуры в 10 раз среднее число клеток в одной полосе
                                                    3
умножают на 10), определяя численность клеток в 1 см .
     При работе с камерой  Горяева  суспензию  водорослей  наносят  по
капле на нижнюю и верхнюю сетки счетной камеры. Затем камеру накрывают
покровным стеклом,  которое притирают  по  бокам  до  появления  колец
интерференции.  Через 1-2 мин начинают подсчет водорослей в 25 больших
                                                               3
квадратах всей камеры. Рассчитывают численность клеток на  1 см  среды
следующим  образом:  количество  клеток  в 25 больших квадратах камеры
                                                                     3
Горяева  умножают  на  104  и   получают  количество  клеток  в  1 см
суспензии.
     Из каждой опытной и контрольной колбы просчитывают не менее  двух
камер.

     Подсчет подвижных   клеток   водорослей   (например,  эксувиеллы)
проводят после фиксации их формалином.
                                            3              3
     Для этого в  мерную  пробирку  на 10 см  помещают 1 см  суспензии
водорослей из опытных  или  контрольных  колб.  Приливают  туда  9  мл
                                                               3
питательной  среды Гольдберга,  перемешивают,  добавляют 0,1 см  4%-го
раствора формалина,  еще раз перемешивают.  Затем из пробирки помещают
каплю суспензии водорослей в камеру Нажотта для подсчета клеток.
     По окончании  эксперимента  на  водорослях   проводят   обработку
полученных  результатов  острого  и  хронического опыта.  Рассчитывают
среднюю   численность   клеток   водорослей   в   опыте   и   контроле
             3
(в млн. кл/см  и в процентах).

     Результаты исследования  учитываются,  если  численность   клеток
водорослей в контроле увеличивается за 96 часов не менее чем в 3 раза.
     При изменении численности клеток в контроле менее чем в  3  раза,
результаты опыта считаются недействительными.

     Достоверность различия  между  численностью  клеток  в контроле и
опыте  устанавливают,  используя   приемы   статистической   обработки
(Приложение 4 данных Методических указаний).
     Достоверность снижения  (или  увеличения)  численности  клеток  в
опыте  по  сравнению с контролем свидетельствует о наличии острого или
хронического  токсического  (эвтрофирующего)  действия   исследованных
концентраций вещества на водоросли.

     2. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для
        макрофитов и высших водных растений

     В прибрежных участках морей макрофиты  (бурые  и  красные  высшие
водоросли),  а  также высшие водные растения,  создают широкий плотный
пояс  фитомассы,  обеспечивающий  первичное  органическое  вещество  и
выделяющий   кислород,  служат  местом  укрытия  от  опасности  водных
организмов,  а в некоторых случаях субстратом для нереста рыб.  Важную
роль играет это звено в самоочищении водных объектов.
     При оценке значения  норматива  (ПДК  вещества)  наиболее  удобно
использовать   в   экспериментах   некоторые  виды  макрофитов  (бурые
водоросли) и погруженные высшие водные растения семейства зостеровых.
     В лабораторных  условиях  указанные  водоросли  и  высшие  водные
растения не культивируются.

     2.1. Характеристика тест-объекта

     2.1.1. Высшие водные растения
     Зостера морская (Zostera marina L.) - растение многолетнее, имеет
ползучее  корневище,  укореняющееся   на   узлах   и   переходящее   в
вертикальный побег. В каждом узле с двух сторон по 8-10 тонких, нежных
корней. Стебель ветвистый, длиной 60-150 см, ветви укороченные. Листья
плоские,  линейные,  длиной  в  среднем  50,  нередко  100 см и более,
шириной 3-9 мм.  Верхушка  листа  округлая.  Соцветие  многоцветковое,
длиной до 8 см, на цветоносных ветвях.
     Распространена в умеренных и теплых водах Северного  полушария  у
берегов  Европы,  в  Тихом  океане  от  Желтого до Берингова моря и до
Калифорнийского залива, также встречается в Карском и Чукотском морях.

     2.1.2. Макрофиты
     В Дальневосточных  морях  удобны для экспериментов в лабораторных
условиях некоторые  виды  макрофитов,  относящиеся  к  красным  высшим
водорослям.

     а) Семейство Phyllophoraceae - Филлофоровые
     Вид Ahnfeltia  tobuchiensis  (Kanno  et  Matsubara)  -  Анфельция
тобучинская
     Слоевище темно-фиолетовое,    упругое,    прочное,    нитевидное,
неправильно  дихотомически  разветвленное,  длиной  7-10 см,  толщиной
0,3-0,45 мм. Органы прикрепления отсутствуют. Образует неприкрепленные
пласты на мягком илистом или песчаном грунте.

     б) семейство Gigartinactae - Гигартиновые
     вид Chondrus pinnulatus (Harv.) - Хондрус перистый
     Слоевище глубокого   фиолетово-карминного  цвета,  светлеющее  до
розовато-фиолетового   и   зеленовато-желтого,   хрящевое,    плоское,
разветвленное,   длиной   10-15  см,  шириной  2-4  мм.  Прикрепляется
дисковидной  подошвой.  Ветви  кверху   клиновидно   расширенные   или
линейные,  ответвляются на некотором расстоянии от подошвы; на вершине
пальчато или вильчато  разветвленные,  снабжены  короткими,  плоскими,
перисто расположенными боковыми веточками.

     2.2. Проведение исследований
     Растения и макрофиты собирают в условно чистом прибрежном  районе
и  предварительно  акклиматизируют  к  лабораторным условиям в течение
недели.  Для опыта отбирают одинаковые экземпляры однолетних  растений
Зостеры (1-2 листа,  стебель,  корень) или одинакового размера участки
таллома макрофитов.
     Зостеру (макрофиты)  по  4  экземпляра  помещают  в контрольные и
                                       3
опытные кристаллизаторы емкостью 0,5 дм  и выдерживают  30  суток  при
постоянном искусственном освещении, температуре 15-17°C.
     С учетом  стабильности  вещества  производят  смену  растворов  в
емкостях.
     Действие растворов  вещества на растения и макрофиты оценивают по
следующим показателям: общее состояние (ежедневно - изменение окраски,
наличие  тургора),  выживаемость (на 7,  14,  21,  30 сутки),  прирост
биомассы (на 10,  20,  30 сутки - в пересчете  на  одно  растение  или
макрофит),  число  корней  и  листьев  (макрофиты) в пересчете на одно
растение (на 10, 20, 30 сутки).

     2.3. Учет и анализ результатов
     Все  результаты   опытов   обрабатываются   статистически   (п. 3
Приложения 4 настоящих Методических указаний).


     3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для
простейших

     3.1. Введение
     Простейшие, в частности инфузории,  составляют до 70% численности
гетеротрофного  микропланктона  в  водных  объектах.  Многочисленность
данной  группы  организмов,  экологическая  значимость  ее в процессах
самоочищения,  в продукционных процессах, трофических связях, значение
ее  как  составной  части  естественной  кормовой  базы зоопланктона и
молоди  рыб  вызывают  необходимость  исследовать  данную   группу   в
токсикологическом  плане.  Наблюдения показали,  что простейшие в силу
своих физиологических особенностей проявляют большую  чувствительность
к  изменению  факторов  внешней среды.  Их короткий цикл развития дает
возможность  проследить  действие  отдельных   токсикантов   на   ряде
поколений.  Данные организмы (особенно ресничные инфузории) достаточно
легко культивировать.  Все это делает простейших удобным тест-объектом
для токсикологических опытов.

     3.2. Характеристика тест-объекта
     В качестве  тест-объектов   в   токсикологических   исследованиях
используются    брюхоресничные    инфузории:   стилонихия,   эуплотус,
керонопсис (Stylonichia mytilus;  Euplotes harpac,  E. trisulkatus, E.
sp.; Urostula marina; Keronopsis multistilata).
     Стилонихия (Stylonichia  mytilus)  -  солоноватоводная  инфузория
(размер до 300 мкм),  в лабораторных условиях адаптируется к солености
до 25%о.  Обитает в водных объектах с большим содержанием органических
веществ,  отмирающих растений,  ила и т.п. Всеядна, в число ее пищевых
объектов  входят  бактерии,  жгутиконосцы,  одноклеточные   водоросли,
детрит.  Стилонихия, подобно другим инфузориям, размножается половым и
бесполым путем.  В процессе бесполого размножения (амитоз) при делении
вегетативного  ядра  (макронуклеуса)  происходит постепенное нарушение
его  генетической  структуры,  что,  в  свою  очередь,  выражается   в
депрессии и старении клона.  При половом процессе в результате слияния
микронуклеусов   двух   конъюгирующих   особей    развивается    новый
макронуклеус,  что  восстанавливает  нормальную генетическую структуру
последнего  и,  соответственно,  нормализует  физиологические  функции
организма.
     Эуплотус (Euplotes harpac),  размер до 450 мкм  -  самая  крупная
инфузория  из  рода Euplotes.  Инфузории этого рода имеют бесцветное и
прозрачное щитовидное тело с  очень  сильно  развитым  перистомом,  10
лобно-брюшных  циррий,  5  поперечных,  4  умеренно развитых хвостовых
циррий играют роль рулей. Инфузории весьма распространены в иле, среди
растительности. Помимо E. harpac используются E. trisulkatus.
     Уростула (Urostula marina),  размер до  200  мкм,  имеет  гибкое,
малосократимое, яйцевидное тело, ширина которого составляет 1/3 длины.
Рот с двумя  ундулирующими  мембранами,  вентральные  ряды  из  низких
циррий,  краевые  ряды  выражены  слабо,  поперечный ряд выражен очень
ясно.  Обитает  среди  растений,  в  незагрязненных  водных  объектах;
прожорливая всеядная форма.
     Керонопсис (Keronopsis  multistilata),  размер  до  450   мкм   -
бентическая  инфузория,  населяет  толщу  прибрежного  морского песка.
Форма длинной ленты,  ширина  составляет  1/7  длины  тела.  Ресничный
аппарат, позволяющий протискиваться между песчинками, хорошо развит.
     Как видно,  используемые в  качестве  тест-организмов  инфузории,
занимают   определенную  нишу  в  водном  объекте.  Они  являются  или
планктонобентосными формами,  или полностью бентическими формами,  что
позволяет   исследовать   как   растворимую  фракцию  веществ,  так  и
малорастворимую.

     3.3. Условия лабораторного содержания
     Монокультуру  простейших  культивируют  при комнатной температуре
20 +/- 2°C  на  искусственной   морской  среде  в  чашках  Петри   при
естественном  освещении,  предохраняя  от воздействия прямых солнечных
лучей, или в люминостате.
     Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и
реактивы, в том числе:
     реактивы для приготовления искусственной морской среды;
     вода дистиллированная;
     бумага фильтровальная;
                     3
     колбы на 1000 см ;
                                                      3
     градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 см ;
     пипетки для  пересадки   простейших   (Пастеровские   пипетки   с
укороченным концом);
                           3
     мерные колбы на 100 см ;
                             3
     мерные пробирки на 10 см ;
     чашки Петри;
     микроаквариумы (блок камер из оргстекла);
     бинокуляр МБС-9 или МБС-10;
     оксиметр;
     рефрактометр для измерения солености воды;
     pH-метр;
     двухромовокислый калий K Cr О  марки "хч" или стандарт-титр калия
                             2  2 7
двухромокислого;
     культура простейших;
     сухие пекарские дрожжи.

     Среда для  культивирования   -   традиционно   используемая   для
простейших.
     Для приготовления  искусственной  морской  среды   делают   запас
                                                                   3
морской  воды соленостью 70%о следующего состава (в граммах на 1 дм ):

NaCl - 55,30;  MgSO  2H O - 13,84;  MgCl  6H O - 11,02; CaCl  6H O  -
                   4   2                2   2               2   2

2,9;  KCl - 1,3;  NaHCO  - 0,5; NaNO  - 0,2; NaBr - 0,2; NaHPO  - 0,1;
                       3            3                         4

KJ - 0,01; SrCl  - 0,03.
               2

     Все компоненты растворяют  отдельно,  через  одни  сутки  сливают
                                                                3
вместе  и  общий  объем  доводят  дистиллированной водой до 1 дм . При
хранении морской воды в растворе может  выпасть  очень  незначительный
осадок солей, отфильтровывать который не рекомендуется.
     Для разведения  искусственной  морской  воды  соленостью  70%о до
нужной солености пользуются формулой Хлебович (1974): X = (1000 *c)/а,
     где X  -  количество  морской  воды,  необходимое  для  получения
искомой солености в 1000 мл дистиллированной воды;
     а - соленость исходной воды (70%о);
     c - соленость искомой воды.
     Можно использовать  для  приготовления искусственной морской воды
готовую профессиональную морскую соль.

     В качестве корма  используют  хорошо  высушенные  и  измельченные
пекарские дрожжи, которые легко хранить в закрытой посуде. Вносят их в
чашки Петри в очень небольшом количестве на кончике скальпеля.

     Два раза в неделю рекомендуется просматривать состояние  культуры
в  чашках Петри.  Через две недели культуру пересевают,  т.е.  100-300
особей пипеткой  переносят  в  чашку  Петри  с  чистой  средой,   куда
добавляют корм.
     Периодически (не  реже  1   раза   в   месяц)   проводят   оценку
физиологической  чувствительности  организмов.  Для  этого  используют
эталонный токсикант - двухромовокислый калий  K Cr О  марки  "хч"  или
                                               2  2 7

стандарт-титр калия   двухромокислого.   Готовят   маточный    раствор

                                          3
двухромокислого калия концентрацией 1 г/дм . Далее методом разбавления
готовят серию растворов с концентрациями 100,0;  150,0; 200,0; 250,0 и

            3
300,0  мг/дм .  Исследование  проводят в течение 24 ч.  По результатам
эксперимента рассчитывают летальную концентрацию  K Cr О ,  вызывающую
                                                   2  2 7

гибель простейших на 50% (ЛК   за 24 ч). Если полученные значения ЛК
                            50                                      50

                                         3
находятся  в  интервале  180-230,0  мг/дм ,  то  культура  может  быть
использована для проведения экспериментов.
     Если полученные  значения  ЛК    не попадают в интервал 180-230,0
                                  50

     3
мг/дм ,  эксперименты с простейшими  не  проводят,  выясняют  причину,
эксперимент повторяют.

     Для получения   из   природных  проб  морской  воды  монокультуры
простейших,  растущих в лабораторных условиях на искусственной морской
среде   той  же  солености,  используют  соответствующие  методические
разработки  (Методические  указания   по   морским   токсикологическим
биотестам.    М.:    ВНИРО,   1978;   Методические   рекомендации   по
биотестированию  природных,  сточных  вод  и  отдельных   загрязняющих
веществ. М.: ВНИРО, 1982).

     3.4. Проведение исследований
     Перед постановкой опытов культуру простейших необходимо вывести в
экспоненциальную фазу развития,  что достигается пересевом культуры за
трое суток до постановки опытов в чашку Петри с добавлением корма.
                                                                    3
     Эксперименты можно  проводить  как в чашках Петри объемом 25 см ,
                                      3
так и в камерах с рабочим объемом 4 см .  Плотность посадки  в  чашках
Петри  (с  рабочим  объемом 10 мл) 10 организмов,  в камерах с рабочим
объемом 4 мл - 5 организмов. Повторность двукратная или трехкратная.
     Для предварительных    и   окончательных   экспериментов   удобно
                                                       3
использовать камеры из оргстекла с рабочим объемом 4 см .  Блок  камер
состоит из двух склеенных между собой пластин размером 20-21x7-8 см. В
верхней пластине толщиной около 1 см просверливают отверстия диаметром
3 cм.  Нижняя пластина толщиной около 0,5 см служит дном.  В блоке  12
камер  (лунок),  которые  расположены в два ряда по шесть в каждом.  В
каждую  лунку  вносят  по  5  инфузорий.  Пять  рядов  используют  для
различных концентраций вещества,  а шестой - для контроля. Повторность
при этом двукратная (два ряда лунок  в  блоке).  Сверху  микроаквариум
закрывают   стеклянной   пластинкой   соответствующего   размера,  что
препятствует испарению раствора.
     В качестве   показателей   токсического   действия  целесообразно
использовать выживаемость и темп деления простейших.
                                                         3
     В первом  случае  в камерах из оргстекла (объем 4 см ) определяют
концентрации вещества, вызывающие гибель (LC  , LC  , LC   ) или любое
                                            16    50    100

повреждающее  действие  (EC  ,  EC  ,  ЕС   ) подопытных организмов за
                           16     50     100

определенный срок.  Длительность опыта определяется токсичностью среды
и  составляет обычно от нескольких часов до 5 суток.  Контролем служит
культуральная среда. Наблюдения проводят под бинокуляром каждые сутки.
     Эксперименты на простейших проводят в два этапа  (предварительный
и  окончательный).  В  предварительном  эксперименте  находят интервал
токсических   концентраций.   Опыты   ставят   в   широком   диапазоне
концентраций     токсиканта,     причем     предыдущую    концентрацию
последовательно увеличивают в 10  раз  (0,1;  1,0;  10,0  и  т.д.).  В
окончательном  эксперименте,  установив  диапазон действия токсиканта,
разбивают  найденный  интервал   на   пять   равных   концентраций   и
устанавливают ЛК  .
                50
     Темп деления  простейших  определяют в микроаквариумах (планшет с
ячейками   (лунки   диаметром   1 см,  глубина  0,5 см).   Планшет   с
микроаквариумами представляет  собой  стеклянный  или изготовленный из
оргстекла квадратный или прямоугольный брусок  толщиной  1 см  с пятью
рядами  полированных лунок.  В каждом ряду,  соответственно,  5 или 10
лунок.  Микроаквариумы накрывают стеклянной  пластинкой  во  избежание
испарения среды из лунок.
     Лунки в каждом ряду (5-10 лунок) заполняются  раствором  вещества
определенной  концентрации.  В каждую лунку микроаквариума помещают по
одному организму.  Ежесуточно в течение нескольких суток  (3-5  суток)
подсчитывают  количество  организмов  в  каждой  лунке  каждого  ряда,
оставляя,  после подсчета  организмов,  в  лунке  исходное  количество
организмов (1 экземпляр), удаляя лишние организмы. Или можно по одному
организму переносить в соответствующую лунку с теми же  концентрациями
вещества аналогичного планшета с микроаквариумами.

     3.5. Учет и анализ результатов
     В качестве  показателя  действия   токсикантов   на   тест-объект
используют  показатель  выживаемости  инфузорий  за  определенный срок
наблюдения или  нарушение  темпа  деления  клеток  инфузорий,  которое
выражается  в  изменении  прироста  численности  клеток в процентах от
контроля.  Прирост   численности   организмов  оценивают  по  формуле:
N = N  - N ,  где  N  - численность  организмов  в  конце  опыта  (или
     t    o         t

последующие сутки подсчета),  a N  - численность организмов  в  начале
                                 o

опыта   (или   предыдущие  сутки  подсчета).  Результаты  обрабатывают
методами статистики.


     4. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для
коловраток

     4.1. Введение
     Коловратки представляют   существенную   часть  планктона  морей,
включая  внутренние  морские  воды  Российской  Федерации  и  являются
наиболее  распространенным  кормом в естественных условиях для личинок
многих  видов  морских  рыб  и  некоторых  беспозвоночных.  Коловратки
эффективно очищают загрязненные воды от бактериальной флоры.  Питаются
бактериями и одноклеточными водорослями.
     Для целей   токсикологического   эксперимента  наиболее  пригодна
коловратка  брасионус  пликатилис  пликатилис  (Brachionus  plicatilis
plicatilis  -  Методические рекомендации по биотестированию природных,
сточных вод  и  отдельных  загрязняющих  веществ.  М.:  ВНИРО,  1982).
Коловратка  легко культивируется в лабораторных условиях при солености
воды 17-25%о.  Имеет короткий жизненный цикл,  дает  ряд  поколений  в
течение нескольких дней.

     4.2. Характеристика тест-объекта
     Коловратка  В. plicatilis  plicatilis  встречается  в   морях   и
внутренних  морских  водах  Российской  федерации.  Вид  эвригалинен и
эвритермен.  Сравнительно большой размер (около  600 мкм)  значительно
облегчает проведение токсикологических экспериментов.
     По систематическому  положению  коловратки  относятся  к   низшим
червям.  Тело коловратки состоит из головы, туловища (покрытого мягким
панцирем) и ноги. На переднем конце головы расположен коловращательный
аппарат  с  ресничками,  который  служит  для плавания и захвата пищи.
Колебанием  ресничек  пищевые  частицы  (микроорганизмы,   простейшие,
детрит,  различные  виды  одноклеточных водорослей) могут привлекаться
или отталкиваться (при избытке или несоответствии пищи).
     В. plicatilis  plicatilis  при  культивировании  в качестве корма
предпочитает  более  мелкие  округлые  водорослевые  клетки.  Обладает
способностью   регулировать   число  заглатываемых  клеток  с  помощью
фильтрующего аппарата. Размеры пищевых частиц не превышают 12-15 мкм.
     Размножается коловратка  как  партеногенетически,  так  и половым
путем.  Жизненный  цикл  В.  plicatilis  plicatilis  состоит  из  трех
периодов: однополого   размножения,  двуполого  размножения  и  стадии
покоя. Эти периоды могут протекать параллельно в одной культуре.
     Период однополого размножения начинается вылуплением амиктических
(партеногенетических) самок из покоящихся яиц.  Амиктические самки  не
способны  к  оплодотворению,  они производят и вынашивают амиктические
яйца,  из  которых  вылупляются  либо  амиктические  самки,  либо   (в
зависимости от условий) миктические самки, способные как к однополому,
так  и  к  двуполому   размножению.   Миктические   самки   вынашивают
миктические   яйца,   из   которых   развиваются   самцы.   В   случае
оплодотворения,  миктическая самка  откладывает  покоящиеся  яйца,  из
которых после латентного периода снова вылупляются амиктические самки.
     Амиктические самки  с  партеногенетическими   яйцами   составляют
основу    здоровой   быстро   размножающейся   популяции   коловраток.
Плодовитость В. plicatilis plicatilis от 1 до 8 яиц на самку.
     После выклева  коловратка  достигает половозрелости через 20-30 ч
при температуре 20-25°C,  через 16-20 ч - при 26-28°C.  В это время  у
нее появляется первое яйцо.  Первый вымет молоди коловратки могут дать
на 2-3 сутки,  но массовый вымет наступает на 3-4  сутки  Плодовитость
самки  зависит  от  ее  физиологического состояния и продолжительности
жизни,  которая колеблется от нескольких дней до 1,5-2 недель. За свою
жизнь   самка   откладывает   несколько   десятков  яиц.  Длительность
сенильного (постпродуктивного) периода самки 2-4 суток.
     Амиктические и  миктические  самки,  присутствующие  в  культуре,
внешне отличаются по наличию определенного типа яиц.
     Амиктические (партеногенетические)  яйца,  из которых развиваются
партеногенетические  самки,  крупные  115-170  мкм,  тонкостенные,   с
полупрозрачным  содержимым,  в  количестве 1-3 у одной самки на разных
стадиях эмбриогенеза, редко до 7-8 штук.
     Миктические покоящиеся  (оплодотворенные)  яйца  в  количестве не
более  3  у  одной  самки  также  крупные,   размером   115-170   мкм,
толстостенные,    непрозрачные,    с    темно-коричневым   содержимым,
прилегающим к оболочке,  или  с  оранжевым  содержимым,  отстоящим  от
оболочки  на  одном  из  полюсов.  Покоящиеся яйца способны переносить
различные  неблагоприятные  условия  в  водном   объекте.   Эти   яйца
морфологически  и  физиологически разнокачественны,  что обуславливает
порционность выхода из них коловраток.
     Миктические яйца, из которых развиваются самцы, мелкие - размером
80-110 мкм,  в количестве от 1 до 12 у одной самки,  с  полупрозрачным
содержимым. Продолжительность жизни самцов 3-4 суток.
     При культивировании  следует  избегать   условий,   при   которых
появляются  миктические  самки,  поскольку  их  покоящиеся  яйца имеют
латентный  период.  Молодь  из  покоящихся   (латентных)   яиц   может
выклевываться через несколько недель, месяцев или даже лет.
     Появление покоящихся яиц в культуре обусловлено резким изменением
одного  или  нескольких  внешних  факторов  (повышением или понижением
температуры, ухудшением кормового режима, изменением солености и др.).
     Переход к двуполому размножению является признаком неблагополучия
в культуре, при этом доля миктических самок превышает 10%.
     При смешанном  размножении в популяции коловраток имеются самцы и
самки   всех   категорий:   ювенильные,   амиктические,    миктические
оплодотворенные  с  покоящимися  яйцами и неоплодотворенные,  а так же
сенильные самки. Наличие разных стадий жизненного цикла и их численное
соотношение характеризуют состояние культуры коловраток.

     4.3. Условия лабораторного содержания
     При культивировании коловраток необходимо поддерживать  на  одном
уровне температуру,  освещенность,  соленость,  концентрацию  корма  и
режим  кормления  во  избежание   перехода   от   партеногенетического
размножения коловраток к половому.
     Культивирование проводят при температуре от 20°C до 25°C, как при
естественном, так и при искусственном освещении (не менее 500-3000 лк)
в люминостате, с естественной сменой дня и ночи.
                                                              3
     Культивируют коловраток  в  колбочках  объемом  50-100 см . Число
колбочек с маточной культурой коловраток должно быть в количестве  2-3
штуки. Средой для культивирования является природная или искусственная
морская вода (п. 2 Приложения 1).
     Кормом являются морские микроводоросли монохризис  или  изохризис
(Monochrysis (Pavlova) lutheri; Isochrysis galbana).
                                                      3
     Корм вносят через  2-3  суток  из  расчета 0,5 см водорослей (при

                                          4   3
плотности клеток культуры водорослей 15x10 /см )  на  10  мл  культуры

                                               3
коловраток при плотности коловраток 5-10 экз/см .
     От концентрации корма  зависят  многие  продукционные  показатели
культуры  коловраток.  Если  концентрация корма выступает лимитирующим
фактором,  то сокращается общая продолжительность жизни организмов, их
плодовитость, скорость рождаемости.
     Избыточное количество  корма  настолько  быстро  проходит   через
пищеварительный  аппарат  коловраток,  что  не усваивается и наступает
парадоксальная  ситуация  -  избыток  корма   приводит   к   голоданию
коловраток   и  снижению  продукционных  показателей,  а  кроме  того,
загрязняет выростные емкости.

     Показателем высокого  качества  маточной  культуры является почти
полное отсутствие самок с миктическими  яйцами,  самок  с  покоящимися
яйцами  и  самцов.  В культуре должны преобладать амиктические самки с
1-3 и более яйцами.
     Маточную культуру коловраток можно создавать  из  яиц  коловраток
(по аналогии с артемиями).

     В том  случае,  когда  маточную  культуру  начинают  создавать от
нескольких десятков амиктических  самок,  культивирование  начинают  в
микроаквариумах.
     В каждую лунку сажают по  одной  амиктической  самке.  Молодь  из
лунок,  появляющуюся в течение трех-четырех дней, переносят в колбочки

                 3
объемом 50-150 см  с морской  водой,  постепенно  увеличивая  маточное
стадо коловраток до 5-10 экз/мл.
                                                                    3
     При достижении  плотности  организмов в культуре 100-200 экз/см ,
среду обновляют:  сливают половину культуры из  колбочки  и  добавляют
свежую среду (искусственную или природную морскую воду).

     Для маточной культуры коловраток желательно иметь хотя бы  1 бюкс
                          3
объемом  не  более  50  см ,  поскольку в бюксе с широким горлом очень
удобно вести контроль за  популяционной  структурой  коловраток.  Бюкс
можно поставить под бинокуляр и просмотреть всю культуру сразу.

     Для культивирования  коловраток  и  проведения  токсикологических
экспериментов необходимы лабораторное оборудование и реактивы:
     весы аналитические;
     бинокуляр МБС-9 или МБС-10;
     pH-метр;
     прибор для измерения солености воды;
     микрокомпрессоры;
     реактивы для  приготовления  искусственной  морской среды  (п. 2,
     Приложения 1 настоящих Методических указаний);
     бумага фильтровальная;
     вода дистиллированная;.
                                     3
     мерные колбы на 1000, 100, 50 см ;
                                    3
     бюксы с широким горлом на 50 см ;
     градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 мл;
     пипетки для   пересадки   коловраток   (пастеровские   пипетки  с
     укороченным концом);
     микроаквариумы;
     культура коловраток Brachionus plicatilis plicatilis;
     морские микроводоросли  для  корма  Monochrysis (Pavlova) lutheri
     или Isochrysis galbana.

     4.4. Проведение исследований

     Токсикологические исследования проводят только на  одновозрастной
культуре коловраток.
     Для получения   большого   количества   одновозрастной   культуры
отбирают   50   активных   самок  с  яйцами  и  помещают  по  одной  в
                                3
микроаквариумы  объемом  0,5  см    каждый   (планшет   с   ячейками).
Появившуюся  молодь  переносят  в  новые  микроаквариумы,  заполненные
морской водой и кормом. Третий помет коловраток, как правило, является
наиболее   плодовитым,  поэтому,  при  необходимости  использования  в
эксперименте  большого  количества  организмов,  удобнее  работать   с
одновозрастной молодью третьего помета.
     Возможно так  же  получение  односуточной культуры для проведения
эксперимента путем замачивания яиц коловраток в морской воде. При этом
происходит  синхронизированный  выклев  молоди  коловраток,  что очень
важно при постановке опыта.
     Односуточная молодь  становиться  половозрелой  через  1-2  суток
(появляется первое яйцо) и дает массовый вымет молоди через 3-4 суток.
     Периодически, не   реже   1  раза  в  месяц  при  культивировании
коловраток,  а также непосредственно перед  постановкой  эксперимента,
необходимо  проводить  контроль чувствительности культуры коловраток к
эталонному веществу - двухромовокислому калию K Cr О  марки  "хч"  или
                                               2  2 7

стандарт-титру  калия  двухромокислого.  Для  этого  готовят  маточный
                                                    3
раствор двухромовокислого калия концентрацией 1 г/дм .  Далее  методом
разбавления  -  серию концентраций 150,0; 180,0; 210,0;  240,0 и 300,0
     3
мг/дм ,  с которыми проводится  исследование.  По  данному  эталонному
веществу  LC   за  24 ч  для  коловраток находится в диапазоне 180-240
            50

мг/л (соленость 20%о).
     Если полученное  значение  ЛК   не  попало  в  указанный диапазон
                                  50

концентраций,  то  эксперименты  с  данной  культурой  коловраток   не
проводят.

     Исследование токсического  действия  веществ  на   тест-организмы
проводят в острых и хронических экспериментах.

     4.4.1. Острое  токсическое  действие вещества исследуют в течение
24 ч. По результатам эксперимента оценивают выживаемость коловраток за
24 ч и определяют ЛК   вещества.
                    50

     Предварительный эксперимент   проводят   с   4-5   концентрациями
вещества,  различающимися в 10 раз; например:, 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10
     3
мг/дм   и  т.д.  Этот опыт позволяет установить границы остролетальных
концентраций вещества.
     Основной эксперимент проводят  по  результатам  предварительного.
Выбирают  диапазон  концентраций  вещества,  которые  вызывают  гибель
меньше 50% и больше 50% коловраток в предварительном эксперименте. Шаг
между концентрациями различается в 2-5 раз.
     В экспериментальные микроаквариумы  объмом  по  0,5  мл  помещают
растворы  исследуемых  концентраций  вещества.  В каждый микроаквариум
рассаживают по одному экземпляру коловраток возрастом 1 сутки, начиная
с  контроля  и  далее  от  наименьшей  концентрации  по возрастанию. В
контроле и в эксперименте (в каждой  концентрации)  используют  по  20
коловраток.
     Условия проведения опытов такие же,  как  и  при  культивировании
данного объекта. В ходе острых опытов коловраток не кормят.

     4.4.2. Хроническое  токсическое действие вещества исследуют около
2 недель (11-14 дней).
     Исследование проводят    на   3-х   поколениях   коловраток.   По
результатам исследования оценивают (по сравнению с контролем):
     а) выживаемость  коловраток  в  разных  концентрациях  вещества в
исходном, в 1-ом, 2-ом и 3-ем поколениях;
     б) наступление Половозрелости в каждом из трех поколений;
     в) плодовитость   коловраток   в   каждом   поколении   и   общую
плодовитость.  Половозрелость  коловраток отмечают с момента появления
первого яйца.
     Плодовитость коловраток - количество молоди, появившейся в каждом
поколении.  Общая   плодовитость   коловраток   в   каждом   поколении
определяется как сумма всей молоди за 4 вымета.
     Для хронических опытов берут не менее 4-5 концентраций  вещества,
в установленном диапазоне по ЛК   за 24 часа.
                               50

     В контроле и опыте (в каждой концентрации) используют не менее 20
коловраток, помещая в каждую лунку микроаквариума по одному экземпляру
возрастом 6 +/- 2 ч.
     Коловраток во время проведения  эксперимента  кормят  водорослями
раз  в  2-3  суток.  Концентрация  клеток водорослей та же,  что и при
культивировании   коловраток.   Предварительно   культуру   водорослей
концентрируют  центрифугированием.  Концентрированный корм добавляют в
каждую лунку на кончике пастеровской пипетки.
     При проведении  опытов  на поколениях коловраток (Таблица 4.4.1.)
придерживаются схемы, аналогично проведению опытов с дафниями.

                                                        Таблица 4.4.1.

              Схема опытов на серии поколений коловраток
----------------------------------------------------------------------
Оцениваемое поколение|      Учитываемые пометы      |   Сумма молоди
---------------------|------------------------------|-----------------
                     |    0     1     2     3     4 |  __   1-4
Исходное X           | X   , X   , X   , X   , X    |  \  X
          исх        |  исх   исх   исх   исх   исх |  /_  исх
---------------------|------------------------------|-----------------
                     |   0    1    2    3    4      |  __   1-4
Первое X             | X  , X  , X  , X  , X        |  \  X
        1            |  1    1    1    1    1       |  /_  1
---------------------|------------------------------|-----------------
                     |   0    1    2    3    4      |  __   1-4
Второе X             | X  , X  , X  , X  , X        |  \  X
        2            |  2    2    2    2    2       |  /_  2
---------------------|------------------------------|-----------------
                     |   0    1    2    3    4      |  __   1-4
Третье X             | X  , X  , X  , X  , X        |  \  X
        3            |  3    3    3    3    3       |  /_  3
----------------------------------------------------------------------

     Примечание. X  -  поколения;  верхний  индекс  -  пометы  каждого
поколения; нижний индекс оцениваемое поколение

     Подготовленную для  эксперимента  культуру  коловраток  (исходную
молодь) рассаживают в микроаквариумы по 1 экземпляру.  После того, как
                                                      1
исходные особи дали первый помет (1-е поколение - X    ),  эту  молодь
                                                   исх
               0
отсаживают  (X   -  "исходная"  молодь первого  поколения)  в  том  же
              1

количестве  в  другие  лунки-микроаквариумы,  соответствующие  тем  же
концентрациям вещества и т.д.
     За исходными  особями ведут наблюдение до получения 4-х пометов в
3-ем опытном и контрольном поколениях.  Наблюдения, которые ведутся за
исходными особями, повторяют с 1-м, 2-м и 3-м поколениями.

     4.5. Учет и анализ результатов
     Для определения   наличия   действия   концентрации  исследуемого
раствора вещества  на  коловратках  отмечают  изменение  выживаемости,
плодовитости,   время  наступления  половозрелости  тест-организмов  в
тестируемом растворе по сравнению с контролем.