|
Расширенный поиск
Приказ Федерального агентства по рыболовству от 04.08.2009 № 695ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ П Р И К А З 4 августа 2009 года Москва N 695 Об утверждении Методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения Зарегистрирован Минюстом России 03 сентября 2009 г. Регистрационный N 14702 В соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 28 июня 2008 г. N 484 "О порядке разработки и утверждения нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, N 27, ст. 3286) п р и к а з ы в а ю : 1. Утвердить по согласованию с Министерством природных ресурсов и экологии Российской Федерации прилагаемые Методические указания по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения. 2. Управлению науки и образования (В.А.Беляев) совместно с Управлением правового обеспечения (Е.С.Кац) направить настоящий приказ на государственную регистрацию в Минюст России в десятидневный срок со дня его подписания. 3. Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на заместителя руководителя Росрыболовства В.В. Рисованого. Руководитель А.А.Крайний Утверждены приказом Росрыболовства от 04.08.2009 г N 695 Методические указания по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения 1. Назначение и область применения 1.1. Методические указания по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ (далее - ПДК веществ) в водах водных объектов рыбохозяйственного значения предназначены для научно-исследовательских и иных организаций, выполняющих работы по разработке нормативов качества воды и ПДК веществ. 1.2. Нормативы качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения характеризуют пригодность ее для обитания водных биологических ресурсов (далее - водные биоресурсы) и обеспечивают безопасность продукции из них. 1.3. Показатели состава и свойств естественного природного состояния воды поверхностных водных объектов определяются физическими, химическими, биологическими и иными показателями, соответствующими природным условиям, не затронутым антропогенным воздействием. 1.4. Общие требования к составу и свойствам воды, в связи с широким влиянием различных видов хозяйственной деятельности на водные объекты рыбохозяйственного значения, установлены на взвешенные вещества, плавающие примеси (вещества), окраску, запахи и привкусы, температуру, водородный показатель, минерализацию воды, растворенный кислород, биохимическое потребление кислорода (БПК), химические вещества, токсичность воды (Приложение 6 данных Методических указаний). 1.5. Методические указания по разработке ПДК веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения предназначены для разработки нормативов, при которых сохраняется биологическое разнообразие и среда обитания водных биоресурсов, обеспечивается добыча (вылов) водных биоресурсов. 1.6. Методические указания по разработке ПДК веществ устанавливают требования к проведению научно-исследовательских работ по определению и обоснованию указанных нормативов в воде водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе в морях или их отдельных частях. 1.7. ПДК веществ устанавливаются по результатам (Приложения 1-4 к настоящим Методическим указаниям) токсикологических исследований вещества на тест-объектах разных трофических звеньев водного объекта (микроорганизмы, фито-, зоопланктон, фитобентос, зообентос, рыбы на разных стадиях развития); оценки влияния веществ на санитарные показатели водной среды; определения стабильности вещества в воде: способности его к накоплению в гидробионтах; исследования генотоксичности; обобщения полученных данных; определения наиболее слабого звена, для которого максимальная недействующая концентрация вещества оказалась наименьшей (Приложение 5 данных Методических указаний). Наиболее слабое звено называют также лимитирующим звеном, максимальная недействующая концентрация которого определяет ПДК вещества. Исследуемый показатель (численность, биомасса, физиологический или гематологический показатель и проч.), для которого определена максимальная недействующая концентрация, называется лимитирующим показателем. 1.8. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 20 декабря 2004 года N 166-ФЗ "О рыболовстве и сохранении водных биологических ресурсов"; статьями 20, 21 Федерального закона от 10 января 2002 N 7-ФЗ "Об охране окружающей среды" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2002, N 2, ст. 133; 2004, N 35, ст. 3607; 2005, N 1, ст. 25; N 19, ст. 1752; 2006, N 1, ст. 10; N 52, ст. 5498; 2007, N 7, ст. 834; N 27, ст. 3213). 2. Общие положения разработки нормативов вещества 2.1. Предельно допустимая концентрация (ПДК) вещества в воде характеризует его максимально допустимую концентрацию (или его метаболитов) в воде, при которой в водном объекте не возникают последствия, снижающие его рыбохозяйственную ценность (в ближайшее время и в перспективе) или затрудняющие его рыбохозяйственное использование при постоянстве этой концентрации в воде водного объекта. 2.2. Ориентировочно безопасный уровень воздействия (ОБУВ) вещества, который оценивается на основе экспресс-экспериментальных и расчетных методов токсичности, характеризует полученное значение, до установления ПДК вещества в воде водного объекта рыбохозяйственного значения, как временный норматив, применяемый не более двух лет. 2.3. При установлении ПДК или ОБУВ вещества по критерию действия вещества на показатели водной среды или на показатели жизнедеятельности различных трофических уровней водных организмов устанавливается лимитирующий показатель вредности (ЛПВ) вещества. Если вещество оказывает прямое токсическое действие на водные организмы, тогда ЛПВ характеризуется как токсикологический и обозначается "токс". При нарушении экологических условий при попадании вещества в воду водного объекта рыбохозяйственного значения: изменение трофности водных объектов; гидрохимических показателей (содержание в воде кислорода, азота, фосфора, изменение pH), нарушение самоочищения воды (биохимическое потребление кислорода (БПК ), численность сапрофитной 5 микрофлорыб), тогда ЛПВ характеризуется как санитарный и обозначается "сан". При действии вещества как на водные организмы, так и на санитарные показатели водного объекта, ЛПВ характеризуется как санитарно-токсикологический и обозначается "сан-токс". Если вещество при попадании в воду образует пленку или пену на поверхности воды, появляются посторонние привкусы и запах воды, наблюдается выпадение осадка, появление опалесценции, мутности и взвешенных веществ, тогда ЛПВ характеризуется как органолептический и обозначается "орг". При этом указывается расшифровка характера изменения органолептических свойств воды (зап. - запах; мутн.- мутность; окр. - окраска; пен. - пена; пл. - пленка; привк. - привкус; оп. - опалесценция и т.д.); При ухудшении органолептических показателей качества рыбы (появление неприятных и посторонних привкусов и запахов) ЛПВ характеризуется как рыбохозяйственный, обозначается "рыб-хоз". 2.4. Для каждого вещества может быть установлена только одна величина норматива (за исключением случаев, предусмотренных условиями нормирования вещества с учетом природных особенностей водных объектов - регионального норматива данного вещества). При утверждении уточненного норматива прежний норматив, установленный ранее для этого вещества отменяется. 2.5. Если исследуемое вещество является структурным аналогом другого вещества, для которого норматив утвержден ранее (т.е. имеет идентичную химическую структуру, но иное товарное название), допускается токсикологическое исследование вещества-аналога лишь по лимитирующим звеньям без выполнения исследований по полной схеме. При совпадении результатов токсикологических исследований с ранее установленным нормативом исследуемое вещество включается в Перечень нормативов в качестве синонима к веществу с ранее установленным нормативом. Если токсичность исследуемого вещества оказывается иной, то необходим подробный его химический анализ и разработка норматива по полной схеме (постановление Правительства Российской Федерации от 12 ноября 1992 г. N 869 "О государственной регистрации потенциально опасных химических и биологических веществ" (Собрание актов Президента и Правительства Российской Федерации, 1992, N 20, ст. 1669); Инструкция Минприроды РФ от 25 мая 1993 г. N 37-2-7/435, Госкомсанэпиднадзора от 25 мая 1993 г. N 01-19/22-22 "О порядке государственной регистрации потенциально опасных химических и биологических веществ" (зарегистрировано в Минюсте России 18 июня 1993 г. N 279). 2.6. При разработке нормативов, как для индивидуальных веществ, так и для смесей, используются одинаковые методические приемы. 2.7. Под индивидуальным веществом понимается вещество, полученное в результате конкретного химического процесса. Индивидуальное вещество может содержать примеси побочных продуктов химической реакции и продуктов его трансформации за счет биологических и физико-химических факторов окружающей среды. 2.8. Совокупность индивидуальных веществ, смешанных до поступления в окружающую среду, характеризует полученную совокупность веществ как смесевое вещество или смесь. 2.9. При разработке ПДК смесевого вещества состав исследуемого препарата должен быть полностью расшифрован заказчиком. В то же время, условия конфиденциальности должны быть обеспечены исполнителем работ на время проведения исследований. 2.10. К образцам веществ, представляемых на токсикологические исследования, должны прилагаться официальные документы, характеризующие их строение, химический состав и подтверждающие соответствие образцов заявленным к исследованию веществам. 2.11. Если исследуемое вещество не растворяется в воде или растворимость его незначительна, изучение влияния этого вещества на тест-объекты проводится при внесении в воду навесок вещества для создания различных его концентраций (п. 2 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям). 2.12. При отсутствии информации в литературных источниках (справочная литература, статьи, паспорт вещества, информационная карта Российского Регистра потенциально опасного химического и биологического вещества) по срокам 50% и 95% распада нормируемого вещества в водной среде, проводят оценку стабильности вещества химико-аналитическим или биологическим методом исследования. Далее классифицируют вещество по степени его стабильности в водной среде (п. 3 Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям) и определяют частоту смены опытных растворов в хронических экспериментах. Стабильность не исследуется для веществ, у которых гибель 50% организмов концентрация средняя летальная (ЛК ) за 96 ч отмечается 50 при 1000 и более мг/л (природные минералы типа графита, силикатного стекла, природной глины и т.д.). 2.13. Оценка мутагенного и канцерогенного действия веществ проводится в том случае, если имеются научные сведения или есть подозрение на образование метаболитов, обладающих генотоксичностью. 2.14. Нормативы ПДК разрабатываются для веществ, используемых в производственной и иной деятельности, связанной с неизбежным сбросом или риском их поступления в водную среду (при транспортировке, погрузочно-разгрузочных операциях и т.д.), при применении на территории водосборной площади. Разработка нормативов осуществляется по запросу Заказчиков. Не требуется разработка ПДК вещества для химически инертных и биологически неактивных веществ (природные минералы типа графита, силикатного стекла и др.), используемых промышленностью, если данные вещества не содержат токсичных примесей, растворимых в воде. К биологически неактивным веществам относятся те вещества, у которых величина ЛК за 96 ч составляет 1000 и более мг/л. 50 Исследования проводят сами разработчики на стандартных зоопланктонных организмах, если нет информации в литературных источниках. Содержание водорастворимых примесей в веществах оценивается в химической лаборатории, аккредитованной в области аналитического контроля. 2.15. Уровень физиологической активности лабораторных культур и выборок тестобъектов периодически контролируются по эффекту на них эталонного (стандартного) токсиканта, для чего определяется ЛК 50 (ЭК ) - концентрация 50% гибели или изменение какого-либо параметра 50 жизнедеятельности организма для этого токсиканта за 24-96 ч. В качестве эталонного токсиканта рекомендуется бихромат калия. Если реакция тестобъекта не соответствует определенному диапазону полулетальных концентраций, тогда с данным тест-объектом эксперименты не проводят. 2.16. При наличии утвержденной величины ПДК вещества для пресноводных водных объектов, возможно (при разработке ПДК этого вещества для морских водных объектов) использование морских тест-объектов для полученных лимитирующих экологических звеньев Для веществ, на которые разработаны нормативы ПДК или ОБУВ, должны быть разработаны и аттестованы методики количественного химического анализа (КХА) этих веществ в воде, сведения об аттестованных методиках (методах) измерений передаются в Федеральный информационный фонд по обеспечению единства измерений проводящими аттестацию юридическими лицами и индивидуальными предпринимателями (статья 5, Федерального закона от 26 июня 2008 N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, N 26, ст. 3021). 3. Общие условия разработки ПДК веществ различного назначения 3.1. Методика определения ПДК вещества предусматривает проведение хронических токсикологических исследований на организмах - представителях основных экологических групп водного сообщества. В процессе экспериментальных оценок токсичности в обязательном порядке должны быть проведены исследования хотя бы на одном представителе каждой из экологических групп. 3.2. Для каждого тест-организма установлен круг тест-параметров (или тест-функций), которые являются основными и контролируются в обязательном порядке. Иные тест-параметры являются вспомогательными и могут быть использованы для уточнения пределов действующих концентраций или для установления особенностей действия исследуемого вещества. 3.3. При выборе концентраций для исследования каждого вещества следует исходить из правил: а) для острых и предварительных исследований выбираются 5-6 концентраций, различающихся между собой в 10 раз; б) при проведении острых опытов определяется ЛК для рыб за 50 96 ч, для одноклеточных водорослей за 72 ч, для зоопланктона за 48 ч. Результаты заносятся в аннотационную карту; в) для более точного определения пороговой концентрации в хронических опытах концентрации могут различаться в 2-5 раз. 3.4. При разработке ПДК для веществ, которые характерны для природных вод (в том числе в геохимических провинциях с пониженным или повышенным их содержанием), необходимо определять концентрацию веществ в воде, которая используется для ведения культур и для опытов. В этом случае норматив определяется (рассчитывается) с учетом природного фонового содержания этого вещества в воде. При определении нормативов для других веществ достаточно убедиться в том, что они отсутствуют в воде, используемой в лабораторной практике. 3.5. Основные правила анализа полученных данных, с целью выведения предельно допустимой концентрации вещества: а) результаты, полученные при действии исследуемого вещества ("опыт"), сопоставляются с результатами наблюдений при отсутствии данного вещества в среде ("контроль"). Особенности вариантов опыта и контроля указаны при описании конкретных методов; б) в эксперименте концентрации считаются действующими, если вызывают не только токсический, но и эвтрофирующий эффект (увеличение численности, биомассы организмов или других регистрируемых параметров); в) достоверность отличия данных в опыте от данных в контроле оценивается статистическими методами (Приложение 4 данных Методических указаний); г) на основании статистической обработки данных устанавливаются максимальные допустимые концентрации для каждого тест-параметра используемого тест-организма, а также для тест-организма в целом; д) максимальная недействующая концентрация для наиболее чувствительного тест-объекта принимается как ПДК исследуемого вещества. Звено, к которому относится данный тест-объект, определяется как лимитирующее при разработке ПДК вещества. 3.6. В связи с высокой токсичностью органических пестицидов, при разработке для них ПДК обязательными являются исследования на рыбах материальной и функциональной кумуляции вещества (накопления вещества в органах и тканях и накопление токсического эффекта организмом). Для расчета максимально недействующей концентрации исследуемого вещества используется пороговая концентрация (К ) - минимальная lim концентрация вещества, вызывающая достоверные изменения в организме, с учетом суммы коэффициентов запаса по стабильности вещества (Кc) в воде, по степени накопления в организмах (Кз ), по степени н накопления токсического эффекта (Кз ): кум ПДК = К / (Кс + Кз + Кз ). lim н кум Для пестицидов, обладающих малой или умеренной стабильностью, ПДК определяется по максимальной недействующей концентрации для лимитирующего звена. 3.7. При исследовании вещества оценивается характер загрязнения водной среды в опыте: опалесценция, пленка, изменение цвета раствора, истинность или коллоидность раствора, для мелкодисперсных взвесей - скорость оседания частиц, органолептическое определение запаха и вкуса (привкуса) воды и пр. 3.8. При величине ПДК вещества 0,00001 мг/л и менее или при лимитирующем показателе "генотоксичность", вещество не рекомендуется для внедрения в производство и в практику. 3.9. Все результаты специализированных научно-исследовательских работ по разработке нормативов обобщаются в Аннотационной карте (Приложение 5 данных Методических указаний). 4. Общие условия разработки ОБУВ веществ различного назначения 4.1. Временные нормативы разрабатываются для веществ различного назначения. 4.2. ОБУВ химических и биологических веществ для пресноводных водных объектов и морей, включая внутренние морские воды Российской Федерации устанавливается в краткосрочных экспериментах сроком не менее 7 суток, в соответствии с п. 8 Приложения 2 и п. 9 Приложения 3 к настоящим Методическим указаниям. При определении ОБУВ пестицидов используется расчетный метод оценки (п. 8.1 Приложения 2). 4.3. Если исследуемое вещество или его химические аналоги по литературным источникам (справочная литература, статьи, паспорт вещества, информационная карта государственной регистрации потенциально опасного химического и биологического вещества) или по показаниям, выявленным в процессе исследований, обладают потенциальной мутагенной активностью, необходимо проведение оценки такой активности. 4.4. В случае, если мутагенное действие оказывается лимитирующим показателем при разработке ОБУВ вещества, данный норматив не утверждается, проводится разработка ПДК вещества в полном объеме в соответствии с настоящими Методическими указаниями. 4.5. Рекомендуемые величины ОБУВ веществ, после их утверждения в установленном порядке, используются на протяжении срока их действия, после чего исключаются из действующих списков нормативов качества воды. 5. Требования к разработке ПДК и ОБУВ биологических препаратов 5.1. Нормативы для бактериальных и других биологических препаратов разрабатываются в соответствии с общими требованиями настоящих Методических указаний по методикам (п. 4.2. Приложения 1; Приложение 2; Приложение 3 данных Методических указаний) с частичными модификациями (указанными ниже: п. 5.2.- п. 5.9). 5.2. При исследовании воздействия биологического препарата на гидрохимический режим не являются обязательными определение БПК , 5 оценка стабильности токсичности препарата, но должна контролироваться концентрация кислорода в среде. 5.3. Должны быть проведены исследования динамики прироста исследуемого штамма в чистой воде (отстоянной водопроводной), в воде водного объекта с природной сапрофитной микрофлорой, и выявлены антагонистические отношения между исследуемым штаммом и природной сапрофитной микрофлорой. 5.4. Если в состав препарата входят два или несколько бактериальных штаммов, исследуется динамика прироста каждого штамма в отдельности. 5.5. При исследованиях штаммов, предназначенных для разложения других веществ, проводится также оценка токсичности продуктов разложения. 5.6. Оценка мутагенного действия биологических препаратов должна проводиться всегда, поскольку модифицированные штаммы бактерий сами способны вызвать мутации. 5.7. Исследования с бактериальными препаратами, предназначенными для деструкции нефти и других субстанций, проводят одновременно в двух вариантах - для оценки биологического действия бактериального препарата в отдельности и в сочетании его с веществом, подвергающимся деструкции. 5.8. Нормативы на биологические препараты приводятся в двойном виде - в мг/л и в виде титра клеток на 1 мл (кл/мл). Если препарат представляет собой смесь штаммов, то указывается общий титр клеток с указанием процентного соотношения штаммов в препарате. 5.9. ОБУВ вещества на биологические препараты определяют по сокращенной схеме: исследуют влияние препарата на органолептические показатели воды, на кислородный режим, динамику сапрофитной микрофлоры, динамику прироста численности исследуемого штамма; оценивают вещество в хронических исследованиях на зоопланктоне и на ранних стадиях онтогенеза рыб (икра, личинки), а также на тест-объектах (из числа включенных в настоящие Методические указания), близких по систематическому положению к организмам, против которых направлены препараты. 6. Требования к разработке ПДК и ОБУВ для смесей постоянного состава 6.1. Под смесями постоянного состава (например, пестициды, некоторые красители, компоненты буровых растворов и проч.) подразумеваются рецептуры (препараты), полученные в результате намеренного смешивания двух или более индивидуальных веществ (п. 2.8, Раздела 2 "Общие положения разработки нормативов вещества"), имеющих (наряду с индивидуальными веществами) соответствующие номера ГОСТа или ТУ, которые определяют свойства этих смесевых веществ (количество и качество примесей). Такие смесевые вещества (препараты) могут иметь свое фирменное (или товарное) название. 6.2. При определении норматива на смесь постоянного состава эта смесь исследуется как единое вещество в соответствии с общими правилами. При этом устанавливается суммарная величина норматива с указанием лимитирующего признака вредности и класса опасности. 6.3. Величина норматива смеси используется для экспертной оценки экологического риска поступления такого вещества в водные объекты, а также для различных технологических расчетов сброса смеси в водные объекты и при оценке ущерба водным биоресурсам. 6.4. Все индивидуальные вещества, входящие в состав смеси, с точки зрения влияния на водную биоту рассматриваются как потенциально опасные или токсичные. На каждый компонент смеси также должна быть установлена величина норматива. 6.5. Нормативы для смеси рассматриваются только в том случае, если установлены нормативы для ее отдельных компонентов. Не нормируются только те компоненты, для которых доказано отсутствие биологической активности на основании представляемых в отчете литературных или собственных экспериментальных данных (например, по оценке величины ЛК , п. 4 Приложения 2; п. 5.1 Приложения 3). 50 Если хотя бы для одного биологически активного компонента смеси в качестве норматива определен ОБУВ, для всей смеси в качестве норматива может быть установлен только ОБУВ. 6.6. ПДК смеси может определяться по сокращенной схеме: а) если все компоненты смеси изучены и их нормативы установлены по одному и тому же лимитирующему признаку вредности, а наиболее чувствительное звено совпадает для всех компонентов, достаточно оценить эффект смеси на это звено и убедиться в отсутствии действия большего, чем аддитивное; б) если лимитирующие признаки вредности и лимитирующие звенья для компонентов смеси различаются, необходимо исследовать влияние смеси на те показатели, которые были определяющими при обосновании ПДК для каждого из компонентов. 6.7. На смесевое вещество устанавливается ПДК, при которой не превышаются нормативы ни на один из его компонентов. Если какой-либо компонент в составе смеси превышает свой норматив при попадании этой смеси в воду, экспериментально установленная величина норматива на смесь корректируется так, чтобы этот компонент в составе смеси не превышал свой норматив. Пример: В состав некоторой смеси входит компонент: "a", составляющий 10%; "b", составляющий 1 % от общей массы смеси, и наполнитель, составляющий 89 %. Ранее установленные ПДК для этих компонентов равны, соответственно, 0,01; 0,0001 и 0,25 мг/л. Результаты исследований выявляют в качестве допустимой для всей смеси концентрацию 0,1 мг/л. При такой концентрации смеси в среде концентрация компонента "а" составит 10% от 0,1 мг/л, т.е. 0,01 мг/л (нет превышения ПДК), компонента "b" - 1% от 0,1 мг/л, т.е. 0,001 мг/л (ПДК для этого компонента превышено в 10 раз), а наполнителя - 89% от 0,1 мг/л, т.е. 0,089 мг/л (превышения ПДК нет). Следовательно, для соблюдения нормативов отдельных компонентов смеси, ПДК для всей смеси необходимо уменьшить в 10 раз, чтобы не превышался норматив для компонента "b". Поэтому ПДК для смеси не должна превышать 0,01 мг/л. 6.8. Аналитический контроль за содержанием смеси в водной среде ведется по индикаторному компоненту или компонентам смеси. Выбор индикаторного компонента проводится на основе следующих принципов: выявление наиболее токсичного и опасного компонента; выбор наиболее стабильного компонента; определение относительной массы (процентного содержания) компонентов смеси; наличие метода определения вещества в воде или его обязательная разработка. 7. Разработка нормативов ПДК веществ с учетом природных особенностей водных объектов 7.1. С целью сохранения сформировавшихся под влиянием природных факторов состава воды водных объектов разрабатываются региональные нормативы: а) для химических элементов, встречающихся в природных водах отдельных геохимических провинций в относительно повышенных или пониженных концентрациях; б) для техногенных аналогов природных веществ, сброс которых требует учета типа принимающего водного объекта и особенностей водосборной территории. К ним относятся вещества, способные повышать сапробность и эвтрофность вод (легко утилизируемые органические соединения и соединения биогенных элементов), изменять солевой режим (минерализацию) и pH природных вод, изменять концентрацию взвешенных (минеральных) веществ природного происхождения, а также соединения и комплексы гуминовых кислот. 7.2. Территории, для которых предполагается разработка нормативов с учетом природных особенностей водных объектов (геохимические провинции, районы с водными объектами определенной трофности, жесткости воды и т.д.), должны быть охарактеризованы: а) по содержанию нормируемого ингредиента в поверхностных водах с целью доказательства повышенного или пониженного его содержания по сравнению со средним его уровнем для поверхностных вод; б) по интегральным показателям качества воды на водосборе, в том числе по содержанию основных компонентов воды и физико-химическим факторам (водные объекты определенной жесткости, трофности и т.д.). 7.2.1. Критерием аномальности естественного уровня (кларка) содержания нормируемого вещества может служить достоверное отличие его (при уровне P<0,5) от среднего содержания в поверхностных водах в меженный период года 95% обеспеченности. 7.2.2. Границы территории, для которой предлагается величина норматива, должны быть определены возможно более точно. 7.3. Нормативы определяются с использованием тест-объектов, предусмотренных настоящими Методическими указаниями, культивируемых на местной воде (водные растения, зоопланктонные организмы, бентосные организмы, аквариумные виды рыб). 7.4. В случае необходимости в общий список тест-объектов могут быть добавлены чувствительные местные виды. Обоснованность данных, полученных на эндемичных видах для определения величины норматива в целом, рассматривается и подтверждается при рекомендации норматива к утверждению. 7.5. При антропогенном загрязнении вод территории (с учетом природных особенностей водных объектов), можно использовать токсикологические данные, полученные на воде и тест-объектах для водного объекта-аналога из незагрязненного района. 7.6. Если на вещество существует утвержденный общероссийский норматив, то региональный норматив может быть установлен по сокращенной схеме. Для этого на местной воде должны быть проведены исследования на тест-объектах, оказавшихся лимитирующими при установлении общероссийского норматива (с учетом требований п.п. 7.3. - 7.5.). 7.7. Величины нормативов ПДК веществ или ОБУВ веществ, с учетом природных особенностей водных объектов, указываются всегда в абсолютном значении, а не в допустимом превышении концентрации над фоновым уровнем. Приложение 1 к Методическим указаниям по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения Общие требования к разработке ПДК веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения 1. Оценка класса опасности вещества 1.1. В основу классификации опасности вещества положены показатели, характеризующие различную степень опасности для водных биоресурсов химических соединений, загрязняющих воду водных объектов рыбохозяйственного значения, в зависимости от токсичности, степени накопления в организмах, способности вызывать отдаленные эффекты, лимитирующего показателя вредности. 1.2. Класс опасности вещества учитывает: а) степень опасности вещества в связи с его появлением в водных экосистемах; б) приоритет при контроле загрязнения среды; в) обоснование рекомендаций о замене хозяйственного использования высоко опасных веществ на менее опасные. 1.3. Выявляются четыре класса опасности веществ, загрязняющих воду водных объектов рыбохозяйственного значения и токсичных для водных биоресурсов. При отнесении вещества к определенному классу опасности учитывается токсичность вещества по величине его ПДК, стабильность этого вещества в водном объекте и его кумулятивные свойства. Отнесение проводится по любому из указанных признаков, одному или нескольким. 1-й класс - чрезвычайно опасные вещества, лимитируемые по токсикологическому и рыбохозяйственному ЛПВ. Степень вредного воздействия на водные биоресурсы очень высокая. Выделяется по следующим признакам: а) ПДК вещества ниже 0,00001 мг/л; б) материальная кумуляция высокая или сверхвысокая (коэффициент накопления К больше 200); н в) стабильность вещества или токсичных продуктов его распада превышает 180 суток при 20°С (r ). 95 К данному классу относятся вещества исключительно антропогенного происхождения (ксенобиотики, не имеющие аналогов в природе). 2-й класс - высоко опасные вещества, лимитируемые по токсикологическому и рыбохозяйственному ЛПВ. Степень вредного воздействия на водные биоресурсы высокая. Выделяется по следующим признакам: а) ПДК вещества от 0,0001 до 0,00001 мг/л (вещества, для которых принимается значение ПДК - "отсутствие", относятся ко второму классу); б) материальная кумуляция умеренная (К от 51 до 200). В н отдельных случаях слабовыраженная (К 1,1-50); н в) стабильность вещества или токсичных продуктов его распада - 60-180 суток при 20°С (r ). Для северных районов, где преобладают 95 низкие температуры воды, эти вещества лимитируются по классу 1. К данному классу относятся вещества исключительно антропогенного происхождения (ксенобиотики, не имеющие аналогов в природе). 3-й класс - опасные вещества, лимитируемые в основном по токсикологическому, иногда по рыбохозяйственному (в том числе и органолептическому) ЛПВ. Степень вредного воздействия на водные биоресурсы средняя. Выделяется по следующим признакам: а) ПДК вещества от 0,01 до 0,0001 мг/л; б) материальная кумуляция слабовыраженная (К 1,1-50). Вещества н не вызывают видимых патологических явлений и легко выводятся из организма; в) стабильность вещества или токсичных продуктов его распада менее 60 суток при 20°С (r ). 95 К данному классу относятся как ксенобиотики, так и вещества природного происхождения (например, сероводород, сульфиды и др.). 4-й класс - умеренно опасные вещества, лимитируемые по любому ЛПВ. Степень вредного воздействия на водные биоресурсы низкая. Выделяются по следующим признакам: а) ПДК вещества выше 0,01 мг/л; б) не обладают кумулятивными свойствами; в) стабильность меньше 10 суток при 20°С (r ). 95 К данному классу относятся частично ксенобиотики (обычно биологически относительно инертные), но в значительной степени - вещества природного происхождения. В 4-м классе выделяются вещества (4-й класс "экологический" - 4э), действие которых проявляется в изменении экологических условий в водном объекте. Это вещества, входящие в состав органики сапробного типа, компоненты минерализации природных вод, биогенные вещества и др. 1.1 Если из трех показателей, характеризующих класс опасности вещества (ПДК, стабильность, степень кумуляции), два последних являются более жесткими величинами при температуре 20 +/- 5°C, чем указано для класса опасности вещества в соответствии со значением его ПДК, тогда класс опасности данного вещества ужесточается на единицу. 1.2 В связи с тем что Россия расположена в различных климатических зонах, учитывается температурный фактор прогрева водных объектов в течение года, и при необходимости класс опасности при высокой среднегодовой температуре воды (20°С) можно снижать, а при более низкой температуре воды (10eC и ниже) повышать, так как в этом случае деградация вещества соответственно увеличивается или замедляется в 3-10 раз. 2. Требования к приготовлению растворов исследуемых веществ при разработке ПДК 2.1 Все вещества (индивидуальные и смесевые) независимо от их растворимости в воде (полной, частичной или отсутствие таковой) должны исследоваться по единой схеме. 2.2 Исходные (маточные) растворы высокой концентрации готовят на дистиллированной воде при установлении норматива вещества для пресноводных водных объектов. 2.3 Исследуемые концентрации веществ (растворимых в воде) готовят из исходного раствора на той воде, которая используется для содержания тест-объекта. Для стабильных веществ возможно приготовление исходных растворов высокой концентрации с последующим приготовлением рабочих растворов на протяжении срока, за который в исходном растворе концентрация вещества практически не меняется. Для нестабильных веществ, когда концентрация их быстро изменяется в растворе, исходные растворы готовят регулярно к каждой очередной замене растворов в экспериментальных сосудах. 2.4 Нерастворимые в воде вещества (минеральные и органические порошки; маслянистые вещества; масла, жиры и их формы; смолистые, вязкие и клейкие органические вещества), как правило, являются высокостабильными. Подход к созданию опытных концентраций должен быть всегда индивидуальным в отношении каждого из вышеуказанных веществ - в зависимости от его формы, химической природы и физико-химических свойств. 2.5 При исследовании нерастворимых в воде веществ важнейшими показателями будут органолептические - образование на поверхности воды мелких масляных шариков, пленки, снижение прозрачности и др., а также гидрохимические и микробиологические показатели (сапрофитная микрофлора, БПК ). 5 2.6 Маслянистые вещества. Исходный раствор готовится в момент постановки опыта. Навеска таких веществ помещается в определенное количество воды и размешивается на магнитной мешалке при 1000 об/мин не менее 1-2 ч. Образуется раствор определенной мутности. Полученную мелкодисперсную водно-маслянную эмульсию используют для приготовления опытных концентраций заданного диапазона. При этом каждую опытную емкость перемешивают в течение 1 минуты для образования гомогенной среды, затем вносят тест-объекты. 2.7 Смолистые, вязкие и клейкие вещества. Исходный раствор вещества готовят аналогично тому, как указано в п. 2.6 настоящих Методических указаний. Навеска вещества должна постепенно, путем подогрева или без него, механическим путем дробиться и растираться до образования максимально однородной массы с водой. Ультразвуковые мешалки полностью гомогенизируют вещество в воде. Полученный исходный раствор используют для приготовления опытных концентраций как указано в п. 2. 6 настоящих Методических указаний. 2.8 Твердые вещества (порошки, гранулы и т.п.), не смешиваемые с водой (всплываемые на поверхность или осаждающиеся на дно). Навеску вещества необходимо тщательно растереть в ступке с небольшим количеством воды до образования однородной гомогенной массы. Продолжая растирание, в ступку постепенно добавлять все большее количество воды. Полученную водную суспензию вещества переливают из ступки в мерную колбу, ступку несколько раз ополаскивают чистой водой и переливают в ту же мерную колбу. Затем в мерную колбу доливают чистую воду до метки, закрывают пробкой, встряхивают. Полученную суспензию используют для приготовления опытных концентраций заданного диапазона. При этом в толще воды опытного сосуда большая часть препарата равномерно распределяется. Часть вещества оседает на дно или всплывает на поверхность. Периодически растворы перемешивают, встряхивая опытный сосуд. 2.9 Газообразные вещества (на примере метана, опыт в закрытых сосудах). Исходный раствор газа для проведения опытов с фитопланктоном готовят на дистиллированной воде, далее разбавляют его до нужной концентрации культуральной средой. Для проведения опытов на других трофических звеньях исходный раствор газа готовят на контрольной воде (отстойной водопроводной, аквариумной; природной или искусственной морской), разбавляя далее этой же водой до нужной концентрации. Для приготовления исходных растворов газа используют пластиковые бутыли емкостью 5 л, заливая их соответствующей контрольной или дистиллированной водой. Бутыль закрывают пробкой с двумя отверстиями, в которые вставлены трубки длиной почти до дна сосуда. Трубки имеют зажимы. Газ с помощью редуктора из газового баллона подается в сосуд через одну из трубок. При этом 1/3 воды вытесняется из бутыли через вторую трубку, над водой оказывается только данный газ. Растворение газа в воде происходит при барбатации и встряхивании бутыли. Аналитическое определение концентрации исходного раствора газа проводят газохроматографическим методом. 3.0. Искусственную морскую воду (соленость 34%о) готовят внесением соответствующих солей в дистиллированную воду, аэрируют ее 10-12 ч, отстаивают 2 недели ("старение воды"). Используют искусственную морскую воду при токсикологических исследованиях только после ее "старения". До нужной солености ее разбавляют дистиллированной водой. pH морской природной или искусственной воды имеет щелочную реакцию, характеризуется величинами в границах 7,8-9. 3. Определение требований к оценке стабильности вещества и стабильности его токсичности в водной среде 3.1. Химико-аналитическое исследование 3.1.1. Время, в течение которого вещество разрушается или улетучивается из раствора, характеризует его стабильность (устойчивость). На основании аналитических определений вычисляют время убывания концентрации вещества в растворе на 95%. Химико-аналитические определения проводят в лабораториях, аккредитованных Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (статья 5, Федерального закона от 26 июня 2008 N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2008, N 26, ст. 3021). Метод химического анализа вещества в воде предоставляется заказчиком разработки норматива ПДК вещества. До начала проведения исследований проводят подготовку необходимого оборудования, приборов, посуды и реактивов согласно методу анализа. Для исследований используют 8 стеклянных емкостей объемом не 3 менее 20 дм . Число емкостей соответствует определенному дню исследований. Емкости наполняют отстоянной природной профильтрованной водой пресноводного водного объекта (природной или искусственной морской водой соленостью 20-34%о). В воде, заливаемой в емкости для приготовления растворов исследуемого вещества, определяют его фоновое содержание. Для создания в емкостях исходной исследуемой концентрации вещества хорошо растворимого в воде, соответствующие его навески вносят непосредственно в подготовленные емкости с водой и тщательно перемешивают. При наличии фонового содержания исследуемого вещества в воде, в опытном растворе учитывается суммарная концентрация вещества при внесении в воду. При выборе концентраций для оценки стабильности меньшая из них должна быть как минимум на 2 порядка выше чувствительности метода. Для исследования веществ не растворимых или мало растворимых в 3 воде используют емкости объемом менее 20 дм (малые емкости) с целью проведения полной экстракции вещества в сосуде (учитывая осаждение вещества на стенках сосуда). Число емкостей соответствует определенному дню исследований. Опыты проводят в емкостях с открытой поверхностью, при температуре 20 +/- 2°C и при естественном освещении. Исследованию подвергаются в двух повторностях три концентрации вещества, меньшая из которых на порядок выше чувствительности метода. Перед каждым отбором проб для анализа, воду в емкостях тщательно перемешивают. Отбор проб и анализ их проводят после приготовления раствора (исходная концентрация - 0 сутки), затем на 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 и 30 сутки от начала эксперимента. Усредненные результаты анализа по повторностям за каждые сутки исследования вносят в таблицу 3.1.1, где представлены данные для одной концентрации. Таблица 3.1.1. Динамика распада вещества в воде в течение 30 суток, мг/л ---------------------------------------------------------------------- Исходная | Экспозиция раствора вещества, сутки концентрация,|------------------------------------------------------- мг/л | 1 | 3 | 5 | 7 | 10 | 15 | 20 | 30 |------------------------------------------------------- | Концентрация вещества в растворе, мг/л --------------|------------------------------------------------------- 10 | 10 | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 ---------------------------------------------------------------------- 3.1.2. Расчет стабильности проводят методом регрессии с учетом того, что убывание концентрации вещества в растворах обычно имеет экспоненциальный характер и описывается уравнением: lgC = lgCo - t/r, где C - концентрация вещества в момент определения (мг/л); Co - исходная концентрация (мг/л); t - время (сутки); r - константа скорости убывания вещества в растворе (сутки). Принимаем lgC = y; lgCo = a; t = х; -1/r = Ь, получаем уравнение y = a + x * b "а" и "b" вычисляем методом наименьших квадратов по уравнениям: __ __ __ __ __ \ y - b * \ x n * \ x * y - \ x * \ y ( /_ /_ ) /_ /_ /_ a = -----------------; b = ------------------------ n __ 2 __ 2 n * \ x - \ x /_ ( /_ ) где n - число определений во времени. На основании расчетов определяют время 95%-го распада вещества в воде. По времени 95%-го распада вещества в водной среде классифицируют его стабильность и определяют коэффициент запаса (Таблица 3.1.2.). Этот же показатель может быть определен и графически. С этой целью строят график убывания концентрации вещества. На осях откладывают время и логарифм концентрации. Из точки на прямой, соответствующей логарифму 5% вещества от исходного уровня, опускают перпендикуляр. Точка пересечения его с осью времени и определит срок разрушения 95% вещества. 3.1.3. По степени стабильности в водной среде препарат относят к одной из шести групп, каждой из которых соответствует определенный коэффициент запаса (К ), приведенный в таблице 3.1.2. c Таблица 3.1.2. Классификация* веществ по их стабильности в водной среде (r = 95%) ---------------------------------------------------------------------- Группы | Стабильность | Время 95%-го распада, | Коэффициент запаса | | сутки | (К ) | | | c --------|----------------|-----------------------|-------------------- 1 | Малая | до 10 | 1,0 --------|----------------|-----------------------|-------------------- 2 | Умеренная | 11-60 | 2,5 --------|----------------|-----------------------|-------------------- 3 | Средняя | 61-90 | 7,5 --------|----------------|-----------------------|-------------------- 4 | Высокая | 91-180 | 13,5 --------|----------------|-----------------------|-------------------- 5 | Очень высокая | 181-365 | 27,0 --------|----------------|-----------------------|-------------------- 6 | Сверхвысокая | более года | - ---------------------------------------------------------------------- Примечание: * Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. Киев: ВНИИГИНТОКС,. 1969 г.) 3.1.4. Стабильность вещества учитывают: при определении класса опасности вещества (п. 1, Приложения 1 к настоящим Методическим указаниям), коэффициента запаса К - при вынесении решения о величине c ПДК для пестицидов. 3.2. Токсикологическое исследование 3.2.1 Необходимость исследования стабильности токсичности обусловлена тем, что химико-аналитические определения не позволяют оценить остаточную суммарную токсичность вещества и продуктов его превращения. Оценку остаточной токсичности проводят методами биотестирования. В качестве тест-объекта рекомендуется использовать организмы зоопланктона (например, одновозрастные дафнии - для пресноводных водных объектов). Возможно использование в качестве тест-объекта других представителей трофической цепи, например, рыб (личинки, мальки, сеголетки). 3.2.2 Исследованию подвергается одна концентрация вещества - ЛК за 24 ч, которая устанавливается для организма в соответствии с 50 общими требованиями для опытов на острую токсичность вещества (п. 4.1.4 Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям). 3.2.3 Раствор вещества данной концентрации (ЛК ) за 24 ч) 50 вносят в восемь емкостей. Каждая емкость соответствует постановке эксперимента в определенный день исследований. 3.2.4 На исходные (0) сутки, далее на 3, на 5, на 7, на 10, на 15, на 20 и на 30 сутки от начала эксперимента в соответствующие емкости вносят по одинаковому количеству тест-объектов (не менее 10 экземпляров). Перед каждым внесением тест-объектов в емкость с раствором, емкость тщательно перемешивают. Через 24 ч после внесения организмов в емкость, учитывают число погибших и удаляют их из емкости. Опыты проводят в 3-кратной повторности. Каждому опыту соответствует контроль. 3.2.5 Полученные экспериментальные данные по соответствующим суткам исследования усредняют по повторностям и рассчитанные проценты погибших экземпляров тест-объекта вносят в таблицу З.2.1., где представлены данные по динамике гибели тест-организмов за 30 суток в растворе вещества с ЛК за 24 ч, равной 10 мг/л. 50 Таблица 3.2.1. Гибель тест-организмов (%) при убывании исходной концентрации вещества (ЛК ) по суткам экспозиции (среднее 3-х повторностей) 50 ---------------------------------------------------------------------- Концентрация,| Сутки исследований ЛК |------------------------------------------------------- 50 | 0 | 3 | 5 | 7 | 10 | 15 | 20 | 30 |------------------------------------------------------- за 24 часа | Гибель тест-объекта, % 10 мг/л |------------------------------------------------------- | 50 | 46,6 | 40 | 30 | 16,6 | 3,3 | 0 | 0 |------------------------------------------------------- | Концентрация вещества в соответствии с ее убыванием | по суткам, мг/л |------------------------------------------------------- | 10 | 9,3 | 8,0 | 6,0 | 3,3 | 0,66 | 0 | 0 ---------------------------------------------------------------------- 3.2.6 На основании полученных данных по гибели тест-организмов в соответствующей емкости, методом пропорции определяется концентрация вещества для каждой величины процента погибших тест-объектов в эксперименте: так, 50,0% погибших организмов соответствуют 10,0 мг/л; 46,6% - 9,3 мг/л; 40,0% - 8,0 мг/л; 30,0% - 6,0 мг/л; 16,6% - 3,3 мг/л; 3,3% - 0,66 мг/л. Полученные значения убывающих концентраций вещества (мг/л) по суткам экспозиции также заносят в таблицу 3.2.1. В случае распада вещества на 20 и на 30 сутки, количество определений во времени (n) увеличивается с 6 до 7 - 8. 3.2.7 Далее расчет периода 95% распада вещества в воде определяют в соответствии с п. 3.1.2: lgC = lgCo - t/r, где C - концентрация вещества в момент определения (мг/л); Co - исходная концентрация (мг/л); t - время (сутки); r - константа скорости убывания вещества в растворе (сут.). Принимают lgC = y; lgCo = a; t = x; -1/r = b, получают решаемое регрессионное уравнение: y = а + x * b Коэффициенты уравнения регрессии "а" и "b" вычисляют методом наименьших квадратов по уравнениям: __ __ __ __ __ \ y - b * \ x n * \ x * y - \ x * \ y ( /_ /_ ) /_ /_ /_ a = -----------------; b = ------------------------ n __ 2 __ 2 n * \ x - \ x /_ ( /_ ) где n - число определений во времени. 3.2.8. Соответствующие данные (расчетные концентрации вещества из таблицы 3.2.1.) вносят в таблицу 3.2.2. и далее проводят преобразование экспериментальных результатов для дальнейшего расчета по формулам п. 3.2.7. Таблица 3.2.2. Данные для расчета распада вещества на 95% ---------------------------------------------------------------------- Число | Сутки |концентрация| логарифм | x * lgC | 2 определений |исследований| вещества. |концентрации| (x * y) | X во времени | t = x | С мг/л | lgC = y | | N | | | | | ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 1 | 0 | 10,0 | 1,0000 | 0 | 0 ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 2 | 3 | 9,3 | 0,9685 | 2,9055 | 9 ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 3 | 5 | 8,0 | 0,9031 | 4,5155 | 25 ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 4 | 7 | 6,0 | 0,7782 | 5,4474 | 49 ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 5 | 10 | 3,3 | 0,5185 | 5,180 | 100 ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 6 | 15 | 0,66 | - 0,1805 | - 2,7075 | 225 ---------------------------------------------------------------------- __ \ Значения сумм вышеуказанных показателей ( /_ ), вносимых в формулы расчета показателей а и b ---------------------------------------------------------------------- N | __ | | __ | __ | __ | \ | | \ | \ | \ 2 | /_ x | | /_ y | /_ (x*y) | /_ х ------------|------------|------------|------------|-----------|------ 6 | 40 | | 4,9878 | 16,3459 | 408 ---------------------------------------------------------------------- 3.2.9. Определяют 5% концентрацию вещества от исходной концентрации (10 мг/л) при его распаде на 95%. В рассматриваемом примере концентрация вещества 0,5 мг/л является 5%-й концентрацией от исходной (10 мг/л) при распаде вещества на 95%. Определяют lg 0,5 = y (y = lgC = lg 0,5 = - 0,301). 3.2.10. Определяют по данным табл. 3.2.2. значения коэффициентов регрессии а и b (п. 3.2.7.): а = 1,6288; b = 0,1196. Подставляют полученные значения в решаемое регрессионное уравнение (п. 3.2.7): y = а + x * b, откуда следует: x = (y - а) / b, где x - время распада вещества на 95%; x = (- 0,301 - 1,6288)/ - 0,1196 - 16,1 При округлении полученного значения x до целого числа, записывают время распада вещества на 95% за 16 суток. 3.2.11. При наличии данных по химической стабильности вещества в растворе и данных по стабильности токсичности вещества может быть проведено сравнение полученных величин и сделан вывод о токсичности продуктов распада вещества. 4. Оценка влияния вещества на показатели водной среды Влияние вещества на показатели водной среды характеризуется по органолептическим (запах, цвет, прозрачность, мутность взвесь, осадок), гидрохимическим (кислород, pH, нитриты, нитраты, аммоний) показателям, а также по показателям, характеризующим самоочищение воды (БПК ), численность сапрофитных микроорганизмов). 5 4.1. Оценка влияния вещества на органолептические показатели воды Органолептические показатели воды при различных концентрациях вещества характеризуют по изменению запаха и цвета, вязкости, опалесценции. А также по изменению прозрачности, мутности, взвеси, образованию осадка в воде - указанные показатели определяют с помощью цилиндра высотой 40 см, емкостью 1 л, на белом основании с темными полосами, нанесенными крестообразно. Определение производят в хорошо освещенных помещениях, но не на прямом солнечном свету. Запах воды при различных концентрациях вещества определяют при комнатной температуре непосредственно из колбы с притертой пробкой. Для этого открывают пробку и слегка втягивают носом воздух из колбы у самого ее горлышка и оценивают наличие запаха. При этом отмечают интенсивность запаха по пятибальной шкале (Таблица 4.1.1). Характер запаха определяют описательно: хлорный, землистый, болотный, хлорфенольный, запах нефти и нефтепродуктов, навозный, гнилостный и т.д. Таблица 4.1.1. Шкала определения запаха по его интенсивности ---------------------------------------------------------------------- Балл | Интенсивность | Оценка ---------------------------------------------------------------------- 0 Нет Запах не ощущается 1 Очень слабый Запах, обнаруживаемый большинством наблюдателей 2 Слабый Запах, обнаруживаемый всеми наблюдателями 3 Заметный Запах легко ощущаемый 4 Отчетливый Запах четко ощущаемый 5 Очень сильный Запах сильный и резкий ---------------------------------------------------------------------- Цвет среды с разными концентрациями вещества сравнивают с цветом контрольной среды, отмечая его интенсивность в каждой концентрации и отмечая концентрацию, при которой цвет среды не отличается от контроля. Прозрачность. Границей изменения прозрачности считают глубину в сантиметрах, при которой исчезает четкая видимость линий на диске основания цилиндра. Мутность воды характеризуют описательно: слабая опалесценция, опалесценция, сильная опалесценция, слабая мутность, заметная мутность, сильная мутность. Осадок характеризуется по его величине - ничтожный, незначительный, заметный, большой. В случае большого осадка указывается толщина слоя осадка в отношении общего объема воды. При качественной характеристике указывают свойства осадка: кристаллический, аморфный, хлопьевидный, илистый, песчаный и т.п., отмечается также цвет осадка - бесцветный, серый, бурый и т.п. В качестве примера приводится табличная запись отмечаемых изменений органолептических показателей воды при различных концентрациях вещества (карбоксиметилированный крахмал, таблица 4.1.1.а). Таблица 4.1.1.a Влияние карбоксиметилированного крахмала на органолептические показатели водной среды ---------------------------------------------------------------------- Концентрация,| Органолептические показатели мг/л |-------------------------------------------------------- | Запах | цвет |Прозрач-| Мутность | Осадок | | | ность | |-------------------------------------------------------- | Вода -------------|-------------------------------------------------------- контроль |естествен-|Естествен-| 40 см |отсутствует| отсутствует | ный | ный | | | ---------------------------------------------------------------------- Карбоксиметилированный крахмал (Floplex C 115) ---------------------------------------------------------------------- 2,0 |отсутствие| без | 40 см |отсутствует| отсутствует | |изменения | | | -------------|----------|----------|--------|-----------|------------- 10,0 |отсутствие| -"- | 40 см |отсутствует| отсутствует -------------|----------|----------|--------|-----------|------------- 25,0 |отсутствие| -"- | 39 см |малая | отсутствует | | | |суспензия | -------------|----------|----------|--------|-----------|------------- 50,0 |отсутствие| -"- | 39 см |малая | отсутствует | | | |суспензия | -------------|----------|----------|--------|-----------|------------- 250,0 |отсутствие| -"- | 35 см |средняя | видимый | | | |суспензия | -------------|----------|----------|--------|-----------|------------- 1250,0 |отсутствие| -"- |30 см |густая | выраженный | | | |суспензия | ---------------------------------------------------------------------- 4.2. Оценка влияния вещества на процессы самоочищения 4.2.1 Вводные замечания Нарушение жизнедеятельности бактериального населения под действием химических веществ может привести к изменению качества водной среды и, в конечном итоге, к деградации экосистемы водного объекта. В связи с этим, при установлении ПДК вещества следует определять его влияние на разные группы бактерий-минерализаторов. Для экспериментального исследования предлагается следующая цепочка объектов: а) сапрофиты, растущие на мясопептонном агаре (МПА) разведенном в 10 раз (МПА:10); б) нитрификаторы 1-й фазы; в) нитрификаторы 2-й фазы. 4.2.2 Характеристика тест-объекта Наибольшей физиологической активностью обладают сапрофиты, первыми начинающие процесс минерализации, разлагая азотсодержащую органику до аммонийного азота. Их сменяют нитрификаторы 1-й фазы, окисляющие аммонийный азот до нитритов, а затем - нитрификаторы 2-й фазы, окисляющие нитриты до нитратов. Для регистрации состояния бактерий в экспериментах предлагается следующий набор основных показателей: а) Численность сапрофитов. Если исследуемое вещество легко усваивается бактериями, их численность значительно возрастает, превышая численность в контроле, а если токсично - количество микроорганизмов снижается. б) Дыхание бактерий. Определяется по БПК . Этот показатель 5 характеризует физиологическую активность бактерий и не всегда коррелирует с численностью бактерий (в связи с тем, что токсическое действие некоторых ксенобиотиков выражается в увеличении численности бактерий на фоне снижения их физиологической активности). в) Концентрация растворенного кислорода. Показатель аэробного состояния среды. г) Аммонийный азот. Продукт метаболизма сапрофитов-аммонификаторов. д) Азот нитритов. Продукт метаболизма нитрификаторов 1-й фазы. е) Азот нитратов. Продукт метаболизма нитрификаторов 2-й фазы. ж) pH среды. Показатель активной реакции среды. Длительность наблюдения обусловлена сроком полной минерализации азотсодержащей органики в нормальных условиях до стабильной формы азота в виде нитратов. Момент окончания опыта определяют выходом концентрации нитратов в контрольном экспериментальном сосуде на стационарный уровень (плато), что происходит на 25-30-е сутки. 4.2.3. Проведение исследований 4.2.3.1. Необходимое оборудование: термостат-стерилизатор; термостат с водяной рубашкой для поддержания температуры 20°С; автоклав; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; потенциометр; 3 мерные колбы на 50, 100, 200, 250, 500 и 1000 см ; 3 стеклянные кристаллизаторы на 5 дм ; 3 кислородные склянки вместимостью около 200 см ; чашки Петри; пробирки, бюретки. 4.2.3.2. Предварительный опыт проводят с пятью или шестью концентрациями исследуемого вещества, различающимися на порядок. Исследование проводят в стеклянных кристаллизаторах, наполовину заполненных природной водой из чистого водного объекта, профильтрованной через мельничное сито N 76. Во все сосуды вносят 3 пептон из расчета 3 мг/дм , который обеспечивает БПК , не 5 3 превышающее 5 мг О(2)/дм , и соответствующее количество исследуемого вещества. В контрольный сосуд исследуемое вещество не вносят. В предварительном опыте контролируется только один показатель - численность сапрофитов, растущих на МПА:10. Посевы проводят в трехкратной повторности глубинным методом. Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 20 +/- 2°C в течение двух суток, после чего просчитывают количество выросших колоний. Отбор проб для посевов проводят ежедневно в течение 4-5 суток. На основании полученных результатов планируют основной опыт. При работе с искусственной морской водой - в подготовленную искусственную морскую воду (п. 2.10 Приложения 1) вносят предварительно выращенную на МПА морскую естественную микрофлору из природной морской воды или морского аквариума (из расчета 1 тыс. кл/мл). Выдерживают при комнатной температуре в течение недели (время адаптации) - для размножения бактерий и стабилизации гидрохимических параметров. После этого проводят токсикологический эксперимент. 4.2.3.3. Основной опыт ставят при тех же условиях, что и предварительный опыт. Оценивают действие вещества в пяти концентрациях, из которых максимальной служит та наименьшая концентрация, которая в предварительном опыте снижала численность сапрофитов по сравнению с контролем более чем на 25%. Другие концентрации различаются не более, чем в 5 раз. Опыт проводят в трех повторностях. 4.2.4. Учет и анализ результатов В ходе длительного опыта учитывают следующие показатели: pH - в исходные, на 10, 20 и 30 сутки; растворенный кислород - в исходные, на 3, 5, 7, 10 и 15 сутки; численность сапрофитов, растущих на МПА:10, - в исходные, на 1, 3, 5 и 7 сутки; БПК - в исходные, на 1, 3, 5 и 7 сутки; 5 азот аммонийный - в исходные, на 1, 3, 5, 7, 10 и 15 сутки; азот нитритов - на 5, 7, 8, 9, 10, 12 и 15 сутки; азот нитратов - на 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25 и 30 сутки. Химические определения проводят по общепринятым методикам. Результаты перечисленных определений обрабатывают статистически и оценивают достоверность отклонения опытных величин от контрольных. Допустимыми концентрациями считаются такие, которые не вызывают достоверного отклонения исследуемых показателей от контрольных. Приложение 2 к Методическим указаниям по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения Требования к разработке максимальных допустимых концентраций вещества для пресноводных биологических тест-объектов 1. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для одноклеточных водорослей 1.1. Введение Планктонные одноклеточные водоросли (фитопланктон), как и высшие водные растения, представляют в водных экосистемах группу организмов-продуцентов. Из двух видов рекомендуемых одноклеточных водорослей (п. 2, Приложения 2) для исследований может быть выбран один, в зависимости от возможностей и традиций лаборатории. Другие виды водорослей могут быть использованы только в дополнение к обязательным видам. Для экспериментов используют культуру водорослей в экспоненциальной фазе роста. Большое значение имеет физиологическое состояние культуры, проверяемое по эталонному (стандартному) веществу. Оценка влияния вещества на одноклеточные водоросли оценивается по показателям изменения численности клеток водорослей (снижение или увеличение) в опытной среде по сравнению с контролем; Достоверное снижение численности клеток водорослей в растворе вещества является показателем токсического действия раствора вещества. Критерием эвтрофирующего эффекта вещества является достоверное увеличение численности клеток водорослей в различных концентрациях вещества. Лимитирующий показатель вредности в данном случае - санитарный. Наряду с изучением динамики численности водорослей, к регистрируемым показателям в опыте следует относить изменение pH; визуальные наблюдения за состоянием культуры водорослей: изменения в окраске, форме клеток и состоянии суспензии (взвешенное, опускание на дно, всплывание к поверхности, гомогенность или агрегация) по сравнению с контролем. В качестве экспресс-метода оценки токсичности (эвтрофирования) химического вещества можно использовать приборный метод быстрой или замедленной флуоресценции водорослей (Минрыбхозом СССР введены в действие методические разработки ВНИРО от 18 декабря 1987 г. N 291-ц "Методические рекомендации по экспрессному биотестированию природных и сточных вод с использованием замедленной флуоресценции одноклеточных водорослей". М: ВНИРО, 1987) Показания изменения флуоресценции водорослей в растворах вещества по отношению к контролю следует относить к основным показателям, характеризующим процессы жизнедеятельности одноклеточных водорослей. Показания быстрой и замедленной флуоресценции относятся только к живым клеткам, отражают интенсивность процесса фотосинтеза водорослей, по калибровочной кривой позволяют определить количество живых клеток в эксперименте. Кратковременная оценка токсичности раствора вещества - до 24-96 ч - позволяет определить наличие острого токсического действия вещества на одноклеточные водоросли, а длительное исследование - до 14 суток - его хроническое токсическое действие. К дополнительным показателям при исследовании следует относить: оценку биомассы водорослей (полученную расчетным методом), оценку скорости и темпа деления клеток (расчет генераций), содержание фотосинтезирующих пигментов (хлорофилла и каротиноидов), соотношение живых и мертвых клеток водорослей (используя люминисцентный микроскоп или различные витальные красители - цитохимический метод). 1.2. Характеристика тест-объекта В качестве основных стандартных тест-объектов используются лабораторные альгологически чистые монокультуры одноклеточных зеленых водорослей сценедесмус и хлорелла, относящиеся к родам сценедесмус (Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., S.acuminatus (Lagerh.) Chod) и хлорелла (Chlorella vulgaris Beyer, Chl. pyrenoidosa Chik). Чаще других в лабораторной практике используют виды S.quadricauda и Chl. vulgaris (сценедесмус квадрикауда и хлорелла вульгарис). Сценедесмус широко распространен в водных объектах России и имеет относительно крупные удлиненно-овальные клетки с закругленными концами. Размер клеток 7-43 x 2,5-16 мкм. Клетки неподвижные, собранные в виде плоских пластинок (ценобии) по 2-,4-, реже 8, 16 клеток. Размножение автоспорами. Автоспоры в материнской оболочке располагаются пучком, после освобождения разворачиваются в виде пластинки. В условиях культуры вместо ценобиев образуются отдельные клетки. Хлорелла распространена в водных объектах южных широт (диаметр клеток 4,2-10,5 мкм). Клетки одиночные, шаровидные, с тонкой оболочкой, без слизи. Хроматофор чашевидный, с пиреноидом. Размножение автоспорами, образующимися по 4-8, реже 16 и освобождающимися через разрыв материнской оболочки. Диаметр клеток 4,2-10,5 мкм. После пересева культур на новую среду экспоненциальная фаза роста наступает на 4 сутки. Численность клеток за 3 суток увеличивается не менее чем в 3 раза. 1.3. Условия лабораторного содержания одноклеточных водорослей. Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе: фильтровальная установка любого типа; фильтры мембранные (размер пор 3,5 мкм, 0,45 мкм); 3 пипетки автоматические-дозаторы объемом 0,1, 0,2 см ; камера счетная Горяева или Фукс-Розенталя; предметные и покровные стекла; климатостат (люминостат) любого типа, оснащенный лампами дневного света 3000 - 6000 лк, обеспечивающий поддержание температуры (20 +/- 2)°C; спиртовка; pH-метр; оксиметр любого типа с погрешностью измерения не более 3 0,5 мг/дм ; микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100-200 раз; 3 стаканы стеклянные лабораторные объемом 100, 500, 1000 см ; 3 колбы конические емкость 50, 100, 250, 1000 см ; эталонное (стандартное) химическое вещество: калий двухромовокислый (бихромат калия) или стандарт-титр калия двухромовокислого для проверки физиологической чувствительности культуры водорослей; культуры зеленых одноклеточных водорослей Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. и Chlorella vulgaris Beyer. Культивируют водоросли (Таблица 1.3.1.) на среде Прата или на среде Успенского N 1 (Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002) Таблица 1.3.1. ---------------------------------------------------------------------- Компоненты среды| Концентрация в среде для| Концентрация исходных | 3 |растворов для приготовления | культивирования, г/дм | 3 | | среды, г/100 см |-------------------------|--------------------------- | Прата |Успенского N 1| Прата |Успенского N 1 ----------------|----------|--------------|------------|-------------- KN0 | 0,1 | 0,025 | 10,0 | 2,5 3 | | | | ----------------|----------|--------------|------------|-------------- MgS0 * 7H 0 | 0,01 | 0,025 | 1,0 | 2,5 4 2 | | | | ----------------|----------|--------------|------------|-------------- Ca(N0 ) - 4H 0 | - | 0,144 | - | 14,4 3 2 2 | | | | ----------------|----------|--------------|------------|-------------- K HPO * 3H O | 0,01 | - | 1,0 | - 2 4 2 | | | | ----------------|----------|--------------|------------|-------------- KH PO * 3H O | - | 0,025 | - | 2,5 2 4 2 | | | | ----------------|----------|--------------|------------|-------------- K СO | - | 0,0345 | - | 3,45 2 3 | | | | ----------------|----------|--------------|------------|-------------- FeCl * 6H 0 | 0,001| - | 0,1 | - 3 2 | | | | ---------------------------------------------------------------------- Питательные среды Прата и Успенского для культивирования водорослей готовят на дистиллированной воде. Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, каждый ее компонент 3 предварительно готовят отдельно в 100 см дистиллированной воды (исходный раствор). Исходные растворы хранят в холодильнике при температуре от + 2°C до + 4°C в течение месяца, в случае помутнения производят их замену. Из исходных растворов каждого вещества (кроме солей железа) по 3 3 1 см добавляют в колбу объемом 1 дм , наполовину наполненную дистиллированной водой (добавление в последовательности расположения веществ в таблице 1.3.1.). Доливают колбу дистиллированной водой до 3 объема 1 дм , перемешивают, после чего питательную среду стерилизуют в автоклаве (30 мин при 1 атм.) или кипячением на водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения стерилизованной среды в нее добавляют соль 3 3 железа в количестве 1 см на 1 дм среды (для среды Прата 1%-ный раствор FeCl * 6H 0; для среды Успенского 1% растворы одного из солей 3 2 железа FeCl , Fe (S0 ) , Fe(NH )(S0 ) или цитрат железа). 3 2 4 3 3 4 2 Приготовленную среду хранят до использования в темном месте при комнатной температуре. Культивируют водоросли в люминостате в конических колбах объемом 3 250-300 см закрытых фольгой или ватно-марлевым тампоном. Освещенность 3000-6000 люкс. Соблюдается световой суточный ритм. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1-2 раза в сутки. Температура при культивировании водорослей 20 +/- 2°C. Повышение температуры до 25°C и выше усиливает токсическое действие, а понижение ее до 12-15°C задерживает проявление эффекта и снижает действие вещества. Водоросли рекомендуется один раз в десять дней пересевать. Для 3 этого в чистую простерилизованную колбу объемом 250 см со свежей средой (100-150 мл) над пламенем спиртовки приливают примерно 3 15-20 см верхнего росткового слоя из колбы ранее культивируемых водорослей. При этом получают начальную плотность клеток в колбе для 3 культивирования, примерно 300 тыс. кл/см . Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном или фольгой, перемешивают, записывают на колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат. В течение дня содержимое колбы перемешивают 1-2 раза. 1.4. Проведение исследований Опыты проводят при оптимальной температуре и освещении (п. 1.3. Приложения 2). Используют водоросли в экспоненциальной фазе роста, что соответствует трехсуточной культуре водорослей после пересева. Плотность культуры в колбе в это время достигает примерно 3 5 млн. кл/см . 3 В опыте используют начальную плотность клеток 25 тыс. кл/см . Для этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом, исходя из объема тестируемой (контрольной, опытной) воды (например, 100 мл) и численности клеток в культуре в экспоненциальной фазе роста (примерно, 3 5 млн. кл/см ). В указанном случае в опытную и контрольную воду 3 добавляется по 0,5 см трехсуточной культуры водорослей. Периодически (не реже 1 раза в месяц) необходимо проводить контроль физиологической чувствительности водорослей. Для этого используют стандартное (эталонное) вещество - двухромовокислый калий K Cr O марки химически чистый ("хч") или стандарт-титр калия 2 2 7 двухромовокислого. Готовят маточный раствор двухромокислого калия концентрацией 3 1 г/дм . Далее методом разбавления - серию растворов с концентрациями 0,12; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мг/л. Исследование проводят в течение 48 ч в трех повторностях. По результатам опыта рассчитывают среднюю концентрацию K Cr O , вызывающую уменьшение численности клеток на 50% 2 2 7 за 48 ч (ЛК за 48 ч). Если полученное значение ЛК находится в 50 50 интервале 1,3-2,5 мг/л, то культура водорослей может быть использована для экспериментов. Если полученные значения ЛК не попадают в указанный интервал, 50 то эксперименты с водорослями не проводят, выясняют причину (условия культивирования, состав культуральной среды и проч.). Иногда культуру водорослей заменяют и проводят эксперименты заново. При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и опытные колбы емкостью 250 мл наливают по 100 мл (в колбы емкостью 100 мл - по 50 мл) контрольной среды или исследуемой концентрации вещества. Контролем служит культуральная среда, на которой культивируются водоросли (среда Прата или среда Успенского N 1). Концентрации веществ также готовят на соответствующей среде. 3 В опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 см 3 (0,25 см ) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста, Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, их содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную 3 численность клеток, которая должна составлять 25 тыс. кл/см . Колбы помещают в люминостат. В эксперименте должно быть исследовано не менее 5 концентраций вещества. Повторность трехкратная. Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа: предварительный и основной (окончательный). В предварительном остром эксперименте находят интервал токсичных концентраций. Опыты проводят в широком диапазоне концентраций вещества, которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент 10). Например, 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее пяти концентраций в двух повторностях. По результатам эксперимента определяется диапазон концентраций для основного острого и хронического эксперимента. В основном остром и хроническом эксперименте шаг между концентрациями изменяется в 2-5 раз. Исследуют не менее пяти концентраций в трех повторностях. Подсчет клеток водорослей проводят в остром опыте ежедневно, в хроническом на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки. На 14 сутки от начала эксперимента опыт прекращают и устанавливают, оказывают ли исследуемые концентрации вещества хроническое токсическое или эвтрофирующее действие на водоросли. 1.5. Учет и анализ результатов Основным критерием токсичности действия веществ на тест-объект следует считать изменение численности клеток водорослей, последовательность прохождения ими всех стадий развития и их способности к размножению. Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или счетную камеру Фукса-Розенталя. При работе с камерой Горяева - камеру и покровное стекло обезжиривают (промывают спиртом). Затем из колбы наносят пипеткой по капле суспензии водорослей на верхнюю и нижнюю сетки счетной камеры, накрывают камеру покровным стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции. Через 1-2 мин начинают подсчет водорослей в 5-и больших квадратах камеры, расположенных по диагонали сетки счетной камеры, или в 25 больших квадратах всей камеры при малой плотности водорослей. Под микроскопом просчет из каждой контрольной и опытной колбы проводят не менее трех раз. По окончании эксперимента рассчитывают численность клеток водорослей в остром и хроническом опытах по сравнению с контролем (в том числе и в процентах). 3 Рассчитывают численности клеток на 1 см среды следующим образом: количество клеток в 25 больших квадратах камеры Горяева 4 3 умножают на 10 , получая количество клеток в 1 см суспензии. Учет численности клеток можно также проводить в камере Фукса-Розенталя объемом 3,2 мл. При высокой численности клеток просчитывают по диагонали 16 квадратов, при малой - считают по всему 3 полю камеры. Количество клеток также выражают в 1 см . Расчет клеток производят по формуле: 3 m * 10 M = --------- n * V 3 где М - количество клеток в 1 см ; m - количество просчитанных клеток (сумма); n - количество просчитанных маленьких квадратов камеры; V - объем части камеры, имеющей площадь маленького квадрата. Результаты исследования учитывают, если численность клеток водорослей в контроле увеличивается за 96 ч не менее чем в 3 раза. При изменении численности клеток в контроле менее чем в 3 раза, результаты опыта считаются недействительными. Используя приемы статистической обработки, устанавливают достоверность различия (снижение или увеличение) численности клеток между и опытом и контролем. Численность живых и мертвых клеток определяют с помощью люминесцентной микроскопии. Ранжируя клетки по интенсивности свечения, можно установить время воздействия вещества на водоросли, степень и скорость отмирания. На практике в основном различают три цвета - жизнеспособные клетки светятся ярким пурпурно-красным светом, отмирающие - различными оттенками тускло-красного или оранжево-красного тона, мертвые - желтовато-салатным. При подсчете клеток водорослей учитываются все три группы - живые, мертвые и отмирающие клетки. В стадии интенсивного роста клеток водорослей в культуре наблюдается минимальное присутствие мертвых клеток. Помимо люминесцентной микроскопии разделение живых и мертвых клеток может проводиться путем микроскопии в видимой области с использованием специальных красителей. Активная реакция среды - изменение pH среды служит интегральным косвенным показателем состояния культуры. Чем выше жизнеспособность водорослей, тем значительнее изменяется на свету реакция среды (подщелачивание) в результате фотосинтетической ассимиляции углекислоты. Измерение pH среды осуществляется с помощью pH-метра, что является обязательным в начале и конце опыта, при хроническом эксперименте - в дни учета биологических показателей. 2. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для высших водных растений Высшие водные (сосудистые) растения являются важным компонентом сообщества организмов-продуцентов водных объектов. Иногда такие растения называют макрофитами из-за их относительно крупных размеров. Высшие пресноводные растения образуют основную фитомассу водных объектов, являются основным звеном, создающим первичное органическое вещество и выделяющим кислород, служат основным субстратом для размножения водных животных и местом их укрытия от опасности. Важную роль играет это звено в самоочищении водных объектов. В схеме определения ПДК вещества это звено представлено (на выбор) двумя видами - укореняющейся Elodea canadensis Rich. (элодея), у которой основная часть стебля взвешена в толще воды, и плавающей Lemna minor L. (ряска), у которой в толще воды располагаются только корешки, а основное растение стелется по поверхности. 2.1. Элодея 2.1.1. Характеристика тест-объекта Элодея (Elodea canadensis Rich.) - представитель погруженных растений, широко распространенный в пресноводных водных объектах умеренной зоны. Размножается вегетативным путем за счет образования густо облиственных боковых отростков, побегов из подземных частей (корневищ) или из нижних частей летних побегов. Теневынослива. Температурная граница выживаемости лежит в пределах от +5°C до 41,5°C. Для культивирования растения отбирают из естественной популяции условно чистого водного объекта в конце мая - начале июня, когда появляется много молодых, наиболее жизнеспособных растений. У элодеи отбирают зеленые верхушечные побеги длиной 8-10 см без боковых отростков и корней, не имеющие видимых повреждений. Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта. 2.1.2. Условия лабораторного содержания В лаборатории элодею размещают в большие широкие, но не глубокие 3 емкости (10 - 15 дм ). Растения проходят акклимацию при комнатной температуре в течение 7-10 дней, достаточной освещенности (лучше - в люминостатной установке) и при смене воды каждые 2-3 суток. Для работы с растениями необходимо следующее оснащение: люминостатная установка; круглые аквариумы на 10-15 л; кристаллизаторы объемом 1 л; стаканы объемом 0,5 л; люксметр; термометр; линейка; глазной пинцет, лезвие; воронка, набор пипеток, стеклянная палочка; планктонный газ N 68, фильтровальная бумага. Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемого водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной продувкой воздуха. Для исследований воду используют через 4-5 дней. Сосуды располагают у окон на дневном рассеянном свету (с южной стороны) или в люминостате при освещенности 1,5-2 лк на протяжении 10-12 ч и при температуре 22-25°C. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром. В воду добавляют среду Успенского N 1 (разведение 1:10), которая способствует быстрому образованию боковых отростков и увеличению биомассы растения и дает возможность круглогодичного содержания растений, пригодных для экспериментов. Предварительно приготовленные основные растворы держат в 3 3 холодильнике, затем из них вносят по 0,5 см на 1 дм дистиллированной воды; pH после стерилизации раствора (равномерным кипячением в течение 0,5 ч) составляет 7,0 - 7,3. 2.1.2.1. Проведение исследований Для экспериментов используют верхнюю часть побега элодеи длиной 4 см без боковых отростков и корней и по 5 экземпляров помещают в кристаллизаторы с растворами исследуемого вещества и с водой без 3 токсиканта объемом по 1 дм . Для каждой концентрации и для контроля используют по три таких сосуда. Сосуды размещают в люминостате или у окон на дневном рассеянном свету с досвечиванием лампами дневного света при температуре 17-22°C и освещенности до 2 лк. До проведения хронического эксперимента следует в предварительном 10-дневном опыте установить диапазон действующих концентраций вещества. Из раствора, вызывающего гибель половины особей (ЛК ) за 50 10 суток, для проведения хронического опыта готовят не менее 3-6 разведений, различающихся между собой на порядок. Опыты, продолжительностью не менее 30 суток, наиболее удобно проводить в летний период. Смену всех растворов и воды в контроле проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2-5 суток. Состояние выборок учитывают каждые 5 суток. 2.1.2.2. Учет и анализ результатов Оценку токсичности веществ для элодеи осуществляют по следующим параметрам: а) состояние растений (изменение окраски, потеря тургора, повреждение точек роста и др.); б) выживаемость и прирост основного побега; в) число боковых отростков и их длина; г) число корней и длина. Прирост основного побега элодеи определяют, вычитая исходные 4 см. Суммарный прирост растения составляется из суммы прироста основного побега и длины боковых отростков. Прирост выражают в сантиметрах, число боковых отростков и корней - в штуках (экз.). У элодеи в лабораторных условиях боковые отростки и корни появляются, как правило, на 10-20 сутки. Отмечают время их появления. Прирост, число и длину боковых отростков и корней рассчитывают на одно растение. 2.1.3. Ряска малая 2.1.3.1. Характеристика тест-объекта Ряска малая (Lemna minor L.) - представитель группы растений с плавающими листьями. Тенелюбива, устойчива к низким температурам. Ее распространение ограничено участками водных объектов с pH от 6,2 до 7,5. Для культивирования растения отбирают из естественной популяции водного объекта в конце мая - начале июня, когда много молодых, наиболее жизнеспособных растений. При отборе ряски выбирают растения с зелеными лопастями и с корнями, не имеющими видимых повреждений. Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта. 2.1.3.2. Условия лабораторного содержания 3 В лаборатории ряску помещают в кристаллизаторы объемом 1 дм с речной или отстоянной водопроводной водой. В течение 7-10 дней растения проходят акклимацию при комнатной температуре и при достаточной освещенности (лучше в люминостатной установке), со сменой воды каждые 2-3 суток для удаления продуктов метаболизма. Для работы с растениями необходимо следующее оснащение: люминостатная установка; 3 круглые аквариумы на 10-15 дм ; 3 кристаллизаторы объемом 1 дм ; 3 стаканы объемом 0,5 дм ; люксметр; термометр; линейка; глазной пинцет, лезвие; воронка, набор пипеток, стеклянная папочка; планктонный газ N 68, фильтровальная бумага. Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязненного водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной аэрацией воды. Для исследований воду используют через 4-5 дней. Ряску в количестве 5 растений, имеющих одну сформировавшуюся и одну развивающуюся лопасть и корень с неповрежденным корневым чехликом, и примерно одинаковой длины, помещают в стаканы объемом 3 0,5 дм и размещают в люминостате при температуре 22-25°C и освещенностью 5 лк. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром. Для круглогодичного культивирования ряски в целях получения достаточного количества материала рекомендуют выращивать их на среде Гапоненко-Стажецкого при круглосуточном освещении 7-8 лк и температуре + 25°C. Состав среды Гапоненко-Стажецкого: KNO - 0,4 г/л, 3 KH PO - 0,2 г/л, 2 4 MgSO - 7H O - 0,3 r/n, 4 2 CaCl - 6H О - 0,6 г/л, 2 2 MnCl - 4H О - 0,3 г/л, 2 2 H BO - 0,5 мг/л, 3 3 цитрат железа - 5 мг/л. Среду автоклавируют при 1,5 атм в течение 20 минут, цитрат железа вносят после стерилизации. 2.1.3.3. Проведение исследований До постановки хронического эксперимента следует провести предварительный 10-дневный опыт для установления диапазона действующих концентраций вещества. Для каждой концентрации и контрольной выборки отводят по 3 стакана. Для проведения хронического опыта из концентрации, вызывающей за 10 суток гибель 50% особей, готовят не менее 3-6 разведений, отличающихся на порядок. Хронические опыты продолжительностью не менее 30 суток наиболее удобно проводить в летний период. Растения по 5 экземпляров 3 рассаживают в стаканы (объем 0,5 дм ), которые размещают в люминостате или на рассеянном свету при температуре 22-25°C и освещенности 3-4 лк. Смену опытных растворов проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2-5 суток, одновременно меняя воду и в контроле. 2.1.3.4. Учет и анализ результатов Состояние растений учитывают каждые 5 суток по выживаемости и изменению ряда биологических показателей. Отмечают общее состояние растений: изменение окраски, размер лопастей, состояние корней), число растений, лопастей и корней в штуках. Общее число лопастей составляет суммарный прирост ряски. Измерения длины проводят с помощью линейки. Все результаты измерений пересчитывают на одно растение. Учитывают сроки образования новых лопастей и корней, а также новых растений, которые приходятся примерно на 10-20-е сутки. 3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для простейших 3.1. Введение Простейшие, в частности инфузории, составляют до 70% численности гетеротрофного микропланктона в водных объектах. Многочисленность данной группы организмов, экологическая значимость ее в процессах самоочищения, в продукционных процессах, трофических связях, значение ее как составной части естественной кормовой базы зоопланктона и молоди рыб вызывают необходимость исследовать данную группу в токсикологическом плане. Наблюдения показали, что простейшие в силу своих физиологических особенностей проявляют большую чувствительность к изменению факторов внешней среды. Их короткий цикл развития дает возможность проследить действие отдельных веществ на ряде поколений. Данные организмы (особенно ресничные инфузории) достаточно легко культивировать. Все это делает простейших удобным тест-объектом для токсикологических опытов. 3.2. Характеристика тест-объекта В токсикологических исследованиях в качестве тест-объектов используется парамеция (Paramecium caudatum Ehrenberg) - свободноживущая широко распространенная ресничная инфузория, предпочитающая альфа-мезосапробные условия. Температурный оптимум лежит в пределах 24-28°C, предпочитает pH, близкую к нейтральной (6,5-7,5). Основными регистрируемыми показателями являются выживаемость и скорость размножения. Выбор парамеции в качестве тест-объекта обусловлен следующими критериями. Благодаря сочетанию в парамеции признаков клетки и организма на ней можно изучить как клеточные, так и организменные формы реакции на токсическое воздействие. Возможность культивирования в широком диапазоне температур позволяет использовать их для экспериментальных работ в любое время года. Короткий жизненный цикл, быстрота размножения позволяют проследить реакцию на интоксикацию в относительно короткий срок в длинном ряду поколений. Используя принцип клонирования, можно получить большое количество генетически однородного материала. 3.3. Условия лабораторного содержания Парамеций выделяют из природных водных объектов или берут чистые 3 культуры из коллекций. Из природных водных объектов банкой на 1 дм у самого берега зачерпывают воду с илом. В тот же день под бинокуляром просматривают пробу. Обнаруженных парамеций последовательно переносят в микроаквариумы сначала со смесью: природная среда и культуральная среда в соотношении 2:1, затем увеличивают содержание культуральной среды в микроаквариумах через каждый час и, наконец, помещают в чистую культуральную среду. Монокультуру простейших культивируют при комнатной температуре 20 + 2°C на среде Лозина-Лозинского в чашках Петри при естественном освещении, предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей или в люминостате. Используется лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе: реактивы для приготовления среды Лозина-Лозинского; вода дистиллированная; бумага фильтровальная; 3 колбы на 1000 см ; 3 градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 см ; пипетки для пересадки простейших (Пастеровские пипетки с укороченным концом); 3 мерные колбы на 100 см ; 3 мерные пробирки на 10 см ; чашки Петри; микроаквариумы (блок камер из оргстекла); бинокуляр МБС-9 или МБС-10; pH-метр; двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия 2 2 7 двухромокислого; культура простейших (Paramecium caudatum Ehrenberg 1838) сухие пекарские дрожжи; Состав минеральной среды Лозина-Лозинского для культивирования P.caudatum: 3 в 1 дм дистиллированной воды растворяют: NaCl - 0,1 г; KCl - 0,01 г; CaCl - 0,01 г; 2 MgCl - 0,01 г; 2 NaHCO - 0,02 г. 3 В качестве корма используют хорошо высушенные и измельченные пекарские дрожжи, которые легко хранить в закрытой посуде. Вносят их в чашки Петри в очень небольшом количестве на кончике скальпеля, или делают суспензию дрожжей и стерильной пипеткой производят подкормку парамеций из расчета 2-3 капли на чашку Петри. Можно в качестве корма использовать (на чашку Петри) частицу дробленного зерна риса. Два раза в неделю рекомендуется просматривать состояние культуры в чашках Петри. Через две недели культуру пересаживают, т.е. 100-300 особей пипеткой переносят в чашку Петри с чистой средой, куда добавляют один из названных видов корма. Не реже 1 раза в месяц проводят оценку физиологической чувствительности организмов. Для этого используют эталонное (стандартное) вещество - двухромовокислый калий K Cr О марки "хч" или 2 2 7 стандарт-титр калия двухромокислого. Готовят маточный раствор 3 двухромокислого калия концентрацией 1 г/дм . Далее методом разбавления готовят серию растворов с концентрациями 100,0; 150,0; 200,0; 250,0 и 3 300,0 мг/дм . Исследование проводят в течение 24 ч. По результатам эксперимента рассчитывают летальную концентрацию K Cr O , вызывающую 2 2 7 гибель простейших на 50% (ЛК за 24 ч). Если полученные значения 50 3 ЛК находятся в интервале 170-220,0 мг/дм , то культура может быть 50 использована для проведения экспериментов. Если полученные значения ЛК не попадают в интервал 170-220 50 3 мг/дм , эксперименты с простейшими не проводят, выясняют причину этого, эксперимент повторяют. 3.4. Проведение исследований Перед постановкой опытов культуру простейших необходимо вывести в экспоненциальную фазу развития, что достигается пересевом культуры за трое суток до постановки опытов в чашку Петри с добавлением корма. 3 Эксперименты можно проводить как в чашках Петри объемом 25 см , 3 так и в камерах с рабочим объемом 4 см . Плотность посадки в чашках Петри (с рабочим объемом 10 мл) 10 организмов, в камерах с рабочим объемом 4 мл - 5 организмов. Повторность - двух или трехкратная. Для предварительных и окончательных экспериментов удобно 3 использовать камеры из органического стекла с рабочим объемом 4 см . Блок камер состоит из двух склеенных между собой пластин размером 20-21 x 7-8 см. В верхней пластине толщиной около 1 см просверливают отверстия диаметром 3 см. Нижняя пластина толщиной около 0,5 см служит дном. В блоке 12 камер (лунок), которые расположены в два ряда по шесть в каждом. В каждую лунку вносят по 5 парамеций. Пять рядов используют для различных концентраций вещества, а шестой - для контроля. Повторность при этом двухкратная (два ряда лунок в блоке). Сверху микроаквариум закрывают стеклянной пластинкой соответствующего размера, что препятствует испарению раствора. В качестве показателей токсического действия целесообразно использовать выживаемость и темп деления простейших. 3 В первом случае в камерах из органического стекла (объем 4 см ) определяют концентрации вещества, вызывающие гибель (LC(16), LC(50), LC(100)) или любое повреждающее действие (EC(16), EC(50), EC(100)) подопытных организмов за определенный срок. Длительность опыта определяется токсичностью среды и составляет обычно от нескольких часов до 5 суток. Контролем служит культуральная среда. Наблюдения проводят под бинокуляром каждые сутки. Эксперименты на простейших проводят в два этапа (предварительный и окончательный). В предварительном эксперименте находят интервал токсических концентраций. Опыты ставят в широком диапазоне концентраций вещества, причем предыдущую концентрацию последовательно увеличивают в 10 раз (0,1; 1,0; 10,0 и т.д.). В окончательном эксперименте, установив диапазон действия вещества, разбивают найденный интервал на пять равных концентраций и устанавливают ЛК . 50 Темп деления простейших определяют в микроаквариумах (планшет с ячейками (лунки диаметром 1 см, глубина 0,5 см). Планшет с микроаквариумами представляет собой стеклянный или изготовленный из оргстекла квадратный или прямоугольный брусок толщиной 1 см с пятью рядами полированных лунок. В каждом ряду, соответственно, 5 или 10 лунок. Микроаквариумы накрывают стеклянной пластинкой, предохраняя испарение среды из лунок. Лунки в каждом ряду (5-10 лунок) заполняются раствором вещества определенной концентрации. В каждую лунку микроаквариума помещают по одному организму. Ежесуточно в течение нескольких суток (3-5 суток) подсчитывают количество организмов в каждой лунке каждого ряда, оставляя, после подсчета организмов, в лунке исходное количество организмов (1 экземпляр), удаляя лишние организмы. Или можно по одному организму переносить в соответствующую лунку с теми же концентрациями вещества аналогичного планшета с микроаквариумами. Информация по документуЧитайте также
Изменен протокол лечения ковида23 февраля 2022 г. МедицинаГермания может полностью остановить «Северный поток – 2»23 февраля 2022 г. ЭкономикаБогатые уже не такие богатые23 февраля 2022 г. ОбществоОтныне иностранцы смогут найти на портале госуслуг полезную для себя информацию23 февраля 2022 г. ОбществоВакцина «Спутник М» прошла регистрацию в Казахстане22 февраля 2022 г. МедицинаМТС попала в переплет в связи с повышением тарифов22 февраля 2022 г. ГосударствоРегулятор откорректировал прогноз по инфляции22 февраля 2022 г. ЭкономикаСтоимость нефти Brent взяла курс на повышение22 февраля 2022 г. ЭкономикаКурсы иностранных валют снова выросли21 февраля 2022 г. Финансовые рынки |
Архив статей
2024 Сентябрь
|
