"Измерение массовой концентрации формальдегида, ацетальдегида, пропионового альдегида, масляного альдегида и ацетона в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. МУК 4.1.2111-06" (утв. Роспотребнадзором 09.08.2006)

количества 2,4-ДНФГ и анализируемого вещества кипятят в очищенном от альдегидов и кетонов этаноле в течение 1 ч в присутствии каталитических количеств хлористоводородной кислоты. Выпавший в осадок 2,4-динитрофенилгидразон соответствующего альдегида (ацетона) отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола до постоянной температуры плавления.
7.4. Подготовка хроматографической колонки
Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.3.2, со скоростью 100 куб. мм/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
7.5. Установление градуировочной характеристики
7.5.1. Строят две зависимости площади хроматографического пика от концентрации альдегидов и ацетона в крови в диапазонах 0,001 - 0,010 мкг/куб. см и 0,01 - 0,10 мкг/куб. см - для альдегидов, 0,01 - 0,10 мкг/куб. см и 0,1 - 2,0 мкг/куб. см - для ацетона. Градуировочные характеристики устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из пяти растворов, готовят из растворов А и В.
7.5.2. Для приготовления градуировочных смесей отбирается проба крови объемом не менее 60 куб. см. В соответствии с п. 8 проводят анализ пробы крови на содержание альдегидов и ацетона. При наличии анализируемых веществ в холостой пробе вычитают их фоновое содержание при построении калибровки.
7.5.3. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах объемом 5 куб. см. Для этого в каждую колбу вносят растворы А и В в соответствии с табл. 1 и 2, прибавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, доводят объем до метки цельной кровью и перемешивают. Анализируют свежеприготовленные растворы.
Таблица 1
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В КРОВИ АЛЬДЕГИДОВ В ДИАПАЗОНЕ
КОНЦЕНТРАЦИЙ 0,001 - 0,010 МКГ/КУБ. СМ И АЦЕТОНА
В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ 0,01 - 0,10 МКГ/КУБ. СМ
--------------------------------------------T-----T-----T-----T-----T-----¬
¦ Номер раствора ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора А, куб. мм ¦0,6 ¦1,2 ¦2,5 ¦4,5 ¦6,5 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация формальдегида, ¦0,001¦0,002¦0,004¦0,007¦0,010¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетальдегида, ¦0,001¦0,002¦0,004¦0,007¦0,010¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация пропионового ¦0,001¦0,002¦0,004¦0,007¦0,010¦
¦альдегида, мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация масляного альдегида, ¦0,001¦0,002¦0,004¦0,007¦0,010¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора В, куб. мм ¦2,5 ¦5,0 ¦10,0 ¦17,5 ¦25,0 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетона, мкг/куб. см ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,07 ¦0,10 ¦
L-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+------
Таблица 2
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В КРОВИ АЛЬДЕГИДОВ В ДИАПАЗОНЕ
КОНЦЕНТРАЦИЙ 0,01 - 0,10 МКГ/КУБ. СМ И АЦЕТОНА
В ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ 0,1 - 2,0 МКГ/КУБ. СМ
--------------------------------------------T-----T-----T-----T-----T-----¬
¦ Номер раствора ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора А, куб. мм ¦6,0 ¦12,5 ¦25,0 ¦44,0 ¦63,0 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация формальдегида, ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,07 ¦0,10 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетальдегида, ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,07 ¦0,10 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация пропионового ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,07 ¦0,10 ¦
¦альдегида, мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация масляного альдегида, ¦0,01 ¦0,02 ¦0,04 ¦0,07 ¦0,10 ¦
¦мкг/куб. см ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Объем раствора В, куб. мм ¦25,0 ¦125,0¦250,0¦375 ¦500 ¦
+-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+-----+
¦Массовая концентрация ацетона, мкг/куб. см ¦0,10 ¦0,5 ¦1,0 ¦1,48 ¦1,98 ¦
L-------------------------------------------+-----+-----+-----+-----+------
В делительную воронку помещают 2,0 куб. см градуировочного раствора, разводят дистиллированной водой до объема 40 куб. см, добавляют 2,0 куб. см 0,2%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения жидкостей верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 20 мин. со скоростью 1500 об./мин., затем 2 куб. см гексана переносят в бюксу и высушивают в потоке воздуха. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см элюента и анализируют аликвотную часть (10 куб. мм) в условиях:
элюент - (ацетонитрил:вода = 60:40) + 2,5% уксусной кислоты + 1%
диэтиламина
колонка 80 х 2 мм, заполнена Диасорбом С16;
скорость движения элюента 100 куб. мм/мин.;
длина волны УФ-детектора 358 нм;
время удерживания:
2,4-динитрофенилгидразона формальдегида 3,10 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона ацетальдегида 3,95 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона ацетона 4,70 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона пропионового альдегида 5,04 мин.;
2,4-динитрофенилгидразона масляного альдегида 7,95 мин.
Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:
n
SUM С / S
i=1 i i
К = -----------,
n
где:
С - концентрация вещества в градуировочной смеси, мкг/куб. см;
i
S - среднее значение пяти измерений площади пика i-й концентрации,
i
единицы оптической плотности (е.о.п.);
n - количество градуировочных смесей (n = 5).
7.6. Отбор проб
Отбор проб венозной крови в объеме не менее 4 куб. см проводят в чистую пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно добавлено 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения пробы в холодильнике - 2 дня.
8. Выполнение измерений
Выполняют два параллельных измерения образца крови. В делительную воронку помещают 2,0 куб. см крови, разбавляют дистиллированной водой до объема 40 куб. см, добавляют по 2,0 куб. см 0,2%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте, 2 капли концентрированной хлористоводородной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После отстаивания верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 20 мин. со скоростью 1500 об./мин. После расслоения жидкостей 2 куб. см гексанового экстракта переносят в бюксу и высушивают в потоке воздуха. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см элюента, вводят в хроматограф аликвотную часть (10 куб. мм) и анализируют в условиях, указанных в п. 7.5.
Идентификацию хроматографических пиков 2,4-динитрофенилгидразонов формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов и ацетона проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и в растворах 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и ацетона, полученных согласно п. 7.3.6.
9. Вычисление результатов измерения
Концентрацию альдегидов и ацетона в крови (мкг/куб. см) вычисляют по формуле:
Х = S х К,
i
где:
Х - концентрация вещества в анализируемой пробе, мкг/куб. см;
S - площадь пика соответствующего 2,4-динитрофенилгидразона альдегида
i
(или ацетона) на хроматограмме, е.о.п.;
К - градуировочный коэффициент.
_
За результат измерения Х принимают среднее арифметическое значение двух
параллельных измерений Х , Х , расхождение между которыми не должно
1 2
превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).
n
_
Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см,
где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:
_
дельта х Х
ДЕЛЬТА = ----------,
100
где дельта - относительное значение характеристики погрешности, %.
10. Внутренний контроль качества результатов измерений
Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".
Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 3 и 4.
Таблица 3
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95
-----------------------T---------------------T----------------------------¬
¦ Наименование ¦Предел повторяемости ¦Предел внутрилабораторной ¦
¦ определяемого ¦ (относительное ¦воспроизводимости (относи- ¦
¦ компонента и ¦значение допускаемого¦тельное значение допускаемо-¦
¦ диапазон измерений, ¦ расхождения между ¦го расхождения между двумя ¦
¦ мкг/куб. см ¦ двумя результатами ¦результатами измерений, по- ¦
¦ ¦ параллельных ¦лученными в одной лаборато- ¦
¦ ¦ определений), r , % ¦рии, но в разных условиях), ¦
¦ ¦ n ¦R_ , % ¦
¦ ¦ ¦ Хl ¦
+----------------------+---------------------+----------------------------+
¦Формальдегид, ¦26,9 ¦28,1 ¦
¦от 0,001 до 0,100 вкл.¦ ¦ ¦
+----------------------+---------------------+----------------------------+
¦Ацетальдегид, ¦21,2 ¦24,8 ¦
¦от 0,001 до 0,100 вкл.¦ ¦ ¦
+----------------------+---------------------+----------------------------+
¦Пропионовый альдегид, ¦25,5 ¦27,4 ¦
¦от 0,001 до 0,100 вкл.¦ ¦ ¦
+----------------------+---------------------+----------------------------+
¦Масляный альдегид, ¦25,1 ¦26,2 ¦
¦от 0,001 до 0,100 вкл.¦ ¦ ¦
+----------------------+---------------------+----------------------------+
¦Ацетон, ¦25,6 ¦28,3 ¦
¦от 0,01 до 2,000 вкл. ¦ ¦ ¦
L----------------------+---------------------+-----------------------------
Таблица 4
ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,
ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
--------------T-----------------T------------------T----------------------¬
¦Наименование ¦Показатель повто-¦Показатель воспро-¦ Показатель точности ¦
¦определяемого¦ряемости (относи-¦изводимости (отно-¦(границы относительной¦
¦компонента и ¦тельное средне- ¦сительное средне- ¦ погрешности при ¦
¦ диапазон ¦квадратическое ¦квадратическое ¦вероятности Р = 0,95),¦
¦ измерений, ¦отклонение ¦отклонение воспро-¦ +/- дельта, % ¦
¦ мг/куб. дм ¦повторяемости), ¦изводимости), ¦ ¦
¦(мкг/куб. см)¦сигма , % ¦сигма , % ¦ ¦
¦ ¦ r ¦ R ¦ ¦
+-------------+-----------------+------------------+----------------------+
¦Формальдегид,¦11,9 ¦12,7 ¦26,5 ¦
¦от 0,001 ¦ ¦ ¦ ¦
¦до 2,000 вкл.¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----------------+------------------+----------------------+
¦Ацетальдегид,¦7,7 ¦10,2 ¦14,2 ¦
¦от 0,001 ¦ ¦ ¦ ¦
¦до 0,100 вкл.¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-----------------+------------------+----------------------+
¦Пропионовый ¦11,3 ¦13,5 ¦24,3 ¦
¦альдегид, ¦