"приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов. методические указания. му 4.2.1103-02"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 27.01.2002)

требует соблюдения правил личной гигиены. Целесообразно сначала приготовить промежуточное разведение, для чего к содержимому ампулы (0,1 мл - 2000 dlm) добавляют 4,9 мл физраствора, получая концентрацию 400 dlm/мл. Пробу готовят из расчета добавления 50 мкл (20 dlm) разведенного токсина на 1 мл. Таким образом, в пробу, конечный объем которой составит 20 мл, необходимо добавление 1 мл разведенного токсина (400 dlm). В этой концентрации наглядную гибель белой мыши на 2-3 день (не позже 4 дня) вызывает инокуляция 0,5 мл пробы (10 dlm).
4.16. В качестве имитатора вируса оспы используют коммерческую
живую вакцину против оспы (осповакцину). Работа с препаратом
должна проводиться при строгом соблюдении правил
противоэпидемического режима, особенно непривитыми лицами. Вакцина
6
содержит около 10 оспообразующих единиц (ООЕ) вируса в одной
прививочной дозе. В ампулу вносят по 100 мкл дистиллированной воды
или физраствора на 1 дозу, а затем вакцину дополнительно разводят
в 10 и 100 раз, получая 3 различных концентрации вакцины: цельную
7 -1
(10 град.) с содержанием вируса 10 ООЕ/мл, 1:10 (10 ) с
6 -2
содержанием вируса 10 ООЕ/мл и 1:100 (10 ) с содержанием вируса
5
10 ООЕ/мл. В пробу вносят по 10 мкл вакцины из того или иного
разведения на 1 мл пробы с учетом конечного объема пробы (см.
п. 4.14.). При этом обычно вирус из разведения 10 град. вызывает
заражение большого числа клеток VERO, НЕР-2, RK-13 и других в
-1
первые сутки; из разведения 10 - гнездное заражение клеток в
-2
течение 30-40 часов, а из разведения 10 - заражение отдельных
клеток позднее 40 часов. Указанный эффект должен быть
предварительно проверен, т.к. он зависит от серии вакцины, условий
ее хранения, чувствительности клеток.
4.17. Приготовление проб с имитаторами ПБА проводят с учетом санитарных правил (п. 2.5.).
5. Приготовление проб с имитаторами
возбудителей сапа, мелиоидоза, глубоких микозов
5.1. Имитатор возбудителя сапа (Burkholderia mallei) представляет собой смешанную взвесь бактерий В.mallei 10230, Р-1 и 712, выращенных при 37 град. С в течение 1-2 суток на МПА с 5% глицерина; имитатор возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - взвесь трех штаммов В.pseudomallei С 141, 101 и 111 (из различных эндемичных регионов мира), выращенных при 37 +/- 0,5 град. С в течение 1 суток на МПА с 5% глицерина. Взвеси обеззаражены формалином в конечной концентрации 1%, что определяет возможность проведения только экспрессного анализа.
5.2. Ввиду антигенного родства обоих микроорганизмов их обнаружение и идентификацию проводят с помощью как групповых, так и видоспецифических иммунодиагностических препаратов. Диагностикум эритроцитарный иммуноглобулиновый сапной взаимодействует с растворимыми и клеточными антигенами возбудителей и сапа, и мелиоидоза. При использовании в МФА группоспецифических люминесцирующих иммуноглобулинов, окрашивающих клетки и В.pseudomallei, и В.mallei, дифференциация их по морфологии клеток практически невозможна. Для видовой дифференциации предназначены видоспецифические препараты.
5.3. Оба имитатора расфасованы в ампулы по 1 мл с содержанием
9
1,0 x 10 микробных клеток по оптическому стандарту (ОСО) мутности
5
10 ед. Чувствительность МФА составляет 1,0 х 10 м.к., а РНГА -
5
5,0 x 10 м.к. Дозы имитаторов, вносимые в образцы проб окружающей
среды, зависят от характера исследуемых объектов, от их
сорбционных свойств. В пробы воздуха, воды, смывов с гладких
поверхностей в расчете на 20 мл пробы добавляют 100-200 мкл (1,0
8 8
x 10 - 2,0 x 10 м.к.) имитатора, в пробу почвы - 100 мкл.
5.4. Для приготовления имитатора возбудителя кокцидиоидомикоза используется взвесь мицелиальной фазы С.immitis 36s (штамм Сильвейра), а имитатора возбудителей гистоплазмоза - типичный штамм Н.capsulatum 6650. Возбудители выращивают 28 суток при 28 град. С на агаре Сабуро с 1,5% дрожжевого экстракта и обезвреживают добавлением формалина до конечной концентрации 0,5%. Это определяет возможность проведения только экспрессного исследования.
5.5. Ввиду наличия общих антигенных связей между возбудителями особо опасных глубоких микозов используются как группо-, так и видоспецифические диагностические препараты. Препараты на основе антител к Н.capsulatum могут выявлять имитатор как этого гриба (причем и мицелиальную фазу, и дрожжеподобные формы), так и С.immitis. Кокцидиоидозные люминесцирующие антитела и эритроцитарные иммуноглобулиновые диагностикумы предназначены для видоспецифической идентификации С.immitis. Особенность МФА состоит не только в степени люминесценции взвеси гриба, но и в выявлении специфически окрашенных характерных для данного вида морфологических элементов (артроконидий с "усиками"). В РНГА выявляется комплекс растворимых антигенов гриба, преимущественно полисахаридной природы.
5.6. Концентрация микробных клеток в ампуле, рассчитанная по ОСО 10 ед., отличается от фактического количества грибных клеток при подсчете в камере Горяева (коэффициент пересчета, как показано в таблице п. 4.6., составляет для С.immitis 1:200, для H.capsulatum - 1:100). Концентрация клеток и чувствительность МФА и РНГА при исследовании чистых культур представлены ниже.
----------------T-----------------------T------------------------¬
¦Вид возбудителя¦ Содержание в ампуле ¦Чувствительность метода¦
¦ ¦ (м.к./мл) ¦ (м.к./мл) ¦
¦ +-----------T-----------+------------T-----------+
¦ ¦ОСО 10 ед. ¦фактическое¦ ОСО 10 ед. ¦фактическое¦
+---------------+-----------+-----------+------------+-----------+
¦ ¦ 9 ¦ 6 ¦ 5 ¦ 3 ¦
¦С.immitis ¦1 x 10 ¦5 x 10 ¦2 x 10 - ¦1 x 10 - ¦
¦ ¦ ¦ ¦ 6 ¦ 4 ¦
¦ ¦ ¦ ¦2 x 10 ¦1 x 10 ¦
+---------------+-----------+-----------+------------+-----------+
¦ ¦ 9 ¦ 7 ¦ 5 ¦ 3 ¦
¦H.capsulatum ¦1 x 10 - ¦1 x 10 - ¦6 x 10 - ¦6 x 10 - ¦
¦ ¦ 9 ¦ 7 ¦ 6 ¦ 4 ¦
¦ ¦5 x 10 ¦5 x 10 ¦6 x 10 ¦6 x 10 ¦
L---------------+-----------+-----------+------------+------------
5.7. Дозы имитаторов, вносимые в образцы проб окружающей среды, зависят от характера исследуемых объектов, от их сорбционных свойств. Рекомендуемые дозы для проб с конечным объемом 20 мл представлены в таблице.
-------------T-------------------------T-------------------------¬
¦ Вид ¦ Воздух, вода, смывы с ¦ Почва ¦
¦возбудителя ¦ гладких поверхностей ¦ ¦
¦ +-------T-----------------+-------T-----------------+
¦ ¦ объем ¦ содержание ¦ объем ¦ содержание ¦
¦ ¦(в мкл)¦микробных клеток ¦(в мкл)¦микробных клеток ¦
¦ ¦ +---------T-------+ +---------T-------+
¦ ¦ ¦по ОСО 10¦факти- ¦ ¦по ОСО 10¦факти- ¦
¦ ¦ ¦ ед. ¦ческое ¦ ¦ ед. ¦ческое ¦
+------------+-------+---------+-------+-------+---------+-------+
¦ ¦ ¦ 8 ¦ 6¦ ¦ 9 ¦ 7¦
¦С.immitis ¦ 40 ¦ 2 x 10 ¦2 x 10 ¦ 200 ¦ 1 x 10 ¦1 x 10 ¦
+------------+-------+---------+-------+-------+---------+-------+
¦ ¦ ¦ 7 ¦ 5¦ ¦ 9 ¦ 7¦
¦Н.capsulatum¦ 40 ¦ 5 x 10 ¦5 x 10 ¦ 200 ¦ 3 x 10 ¦3 x 10 ¦
L------------+-------+---------+-------+-------+---------+--------
6. Приготовление проб с риккетсиями и коксиеллами
6.1. Для приготовления проб используются коммерческие препараты, представленные в Прилож. 3 (N 7, 12-15). Растворимые антигены в препаратах, предназначенных для постановки реакции связывания комплемента, хорошо выявляются с помощью реакции пассивной гемагглютинации, а корпускулярные антигены - в МФА. При этом возможно проведение только экспрессной диагностики. В целях ускоренной диагностики и проверки режима работы с микроорганизмами используется вакцина Е сыпнотифозная комбинированная живая сухая. Работа с ней требует строгого соблюдения противоэпидемического режима и сопряжена с необходимостью проведения 3-4-кратного пассажа штамма на куриных эмбрионах. Интенсивность роста риккетсий контролируют микроскопией мазков-отпечатков стенок желточного мешка с помощью МФА.
6.2. Оптимальной вносимой в пробу дозой диагностикума Провачека или Сибирика, выпускаемых для целей исследования материала в РСК, является доза с концентрацией антигена, дающей положительный результат в РПГА не менее чем в трех последовательных разведениях. Такая концентрация обеспечивается при использовании 1 ампулы диагностикума для приготовления одной имитированной пробы объемом 20 мл. Недостаточное количество антигена в пробе приводит к получению ложноотрицательного результата РПГА, а его избыточная концентрация - к перерасходу сыворотки для торможения РПГА (РТПГА).
6.3. Диагностикумы разводят согласно указанию на ампуле и выдерживают 3 ч при комнатной температуре для полной регидратации. Корпускулярный антиген после разведения тщательно диспендируют шприцом с тонкой иглой, или пипеткой с тонко оттянутым концом, как это было уже указано в п. 4.10., титруют и приготовляют мазки на предметном стекле (антигенные пятна). Мазки подсушивают, фиксируют 30 мин. в ацетоне или в 96-градусном этаноле и окрашивают люминесцирующей сывороткой. Оптимальным считается наличие 5-10 корпускул в поле зрения. Выбранную концентрацию увеличивают в несколько раз с учетом последующего усреднения пробы. Для корпускулярного Ку-риккетсиозного диагностикума, разведенного в объеме 1 мл, ориентировочной дозой является 15 мкл суспензии на 1 мл пробы. Количество корпускул в пробе для каждой серии диагностикума должно быть проверено указанным выше способом.
6.4. В пробу целесообразно вносить и растворимый, и корпускулярный антигены.
7. Программа составления проб
7.1. При подготовке значительного количества проб для одной или нескольких лабораторий целесообразно заранее составлять программу добавления биологических агентов, которая позволяла бы предвидеть конечный результат специфической индикации ПБА. В программе для каждой пробы указывается "легенда", число микробных клеток в исходной суспензии, объем суспензии и содержащееся в нем число микробных клеток (антигена или количества токсина), добавляемых в пробу, и т.д. Программа оформляется в виде протокола внесения патогенных агентов в пробы. Образец такого протокола представлен в Прилож. 4. Данный образец содержит 17 различных разновидностей биологических агентов (имитаторы ПБА и условно-патогенные микроорганизмы), расположенных в порядке внесения в пробы согласно п. 4.13. Так как некоторые биологические агенты вносятся в пробы из разных разведений, то всего в образце протокола представлено внесение этих 17 БА в 29 различных вариантах. Эти варианты могут быть использованы для приготовления большого количества разнообразных проб. В графе 9 протокола указаны ПБА, внесенные в пробы N 1-24, а последующие всевозможные номера отмечены точками.
7.2. Подготовка имитаторов в разных разведениях позволяет готовить пробы с различными концентрациями имитатора: высокой, средней и низкой. Высокая концентрация обнаруживается достаточно уверенно, а низкая выявляется только при хорошем уровне подготовки лаборатории, после предварительной концентрации проб или заведомо рассчитана на обнаружение ПБА после подращивания микроорганизмов.
7.3. Поскольку экспрессное исследование проводится из пробы объемом 3-5 мл, то теоретически рассчитанное количество БА, указанное в графе 6 Прилож. 4, можно заранее сопоставить с чувствительностью МФА и РНГА. В графе 8 указано теоретическое количество микробных клеток, которое можно ожидать при высевах на плотные питательные среды.
7.4. Протокол внесения патогенных биологических агентов может быть подготовлен в варианте, когда ПБА указаны для каждой пробы индивидуально. Такой вариант для двух лабораторий (для проб N 1-24) представлен в Прилож. 5.
7.5. Протокол внесения биологических агентов может быть подготовлен также с указанием ожидаемых результатов (Прилож. 6). В этом виде протокол можно использовать в ходе проведения специфической индикации. Ожидаемое время получения первого положительного ответа в соответствии с п. 7.3. ориентировано на использование МФА и РНГА. При добавлении "подпороговых" количеств имитатора время ожидаемого первого ответа, как отмечено выше, составляет до 24 ч. Однако при использовании лабораторией дополнительных высокочувствительных методов исследования, таких как ИФА и (или) ПНР, ответ может быть получен уже при экспрессном исследовании.
7.6. V.cholerae не О1 в протоколе 3 отнесен к имитаторам ПБА (см. п. 4.5.), в связи с чем указан результат исследования и возможное время выдачи ответа. Направление должно содержать указание на проведение соответствующих исследований, т.к. в противном случае поиск может ограничиться только теми ПБА, обнаружение которых возможно при экспрессном анализе.
7.7. Содержание БА в пробах N 1-24 всех трех протоколов одинаковое. При передаче проб в исследовательскую лабораторию можно использовать один, два или все три протокола, т.к. они не дублируют друг друга. Каждый из них, как видно из таблицы, имеет определенное назначение.
ВАРИАНТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОТОКОЛОВ ВНЕСЕНИЯ ИМИТАТОРОВ
-------------------------------------------T---------------------¬
¦ Показатель ¦ N протокола ¦
¦ +------T-------T------+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦
+------------------------------------------+------+-------+------+
¦Возможность перемены посредником номеров ¦ ¦ х ¦ х ¦
¦проб (шифрования проб) ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------------------------------+------+-------+------+
¦Целесообразность использования при ¦ х ¦ ¦ ¦
¦внесении БА ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------------------------------+------+-------+------+

Медицинское законодательство »