"приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов. методические указания. му 4.2.1103-02"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 27.01.2002)
¦ ¦ ¦ 8 ¦ 9 ¦
¦10
¦R.prowazekii ¦0,8 ¦6,5 x 10 ¦1,3 x 10 ¦
+---+----------------------+-----------+------------+------------+
¦
¦ ¦ ¦ 9 ¦ 9 ¦
¦11
¦C.burneti ¦0,15 ¦3,3 x 10 ¦6,6 x 10 ¦
+---+----------------------+-----------+------------+------------+
¦
¦ ¦ ¦ 8 ¦ 9 ¦
¦12
¦B.mallei ¦1,0 ¦5,0 x 10 ¦10 ¦
+---+----------------------+-----------+------------+------------+
¦
¦ ¦ ¦ 8 ¦ 9 ¦
¦13
¦B.pseudomallei ¦1,0 ¦5,0 x 10 ¦10 ¦
+---+----------------------+-----------+------------+------------+
¦
¦ ¦ ¦ 6 ¦ 6 ¦
¦14
¦C.immitis ¦200 ¦2,5 x 10 ¦5,0 x 10 ¦
+---+----------------------+-----------+------------+------------+
¦
¦ ¦ ¦ 6 ¦ 7 ¦
¦15
¦H.capsulatum ¦100 ¦5,0 x 10 ¦10 ¦
L---+----------------------+-----------+------------+-------------
4.7.
Живые вакцинные штаммы можно
подготавливать для внесения в пробы в двух
вариантах:
- с предварительным
подращиванием на плотных питательных
средах, что рекомендуется для чумной
вакцины, сибиреязвенной вакцины, которую в
вегетативной форме целесообразно вносить в
биологические объекты. Подращивание
проводят при 37 +/- 0,5 град. С в течение 1 суток
(для штамма EV чумного микроба - 1 сутки при 28
+/- 0,5 град. С и 1 сутки при 37 +/- 0,5 град. С, что
способствует обнаружению микроба за счет
образования фракции F1, выявляемой при
помощи МФА и РНГА). Более длительное
выращивание биологических агентов
нежелательно, т.к. оно приводит к увеличению
числа отмерших микробных клеток, и в
суспензии, приготовленной по стандартному
образцу мутности, будут присутствовать как
живые, так и нежизнеспособные клетки;
-
без подращивания, непосредственно после
3-6-часовой регидратации содержимого ампулы.
В таком виде хорошо обнаруживаются
методами экспрессного анализа вакцинные
штаммы туляремийного, бруцеллезного
микроба, споры сибиреязвенного микроба,
которые целесообразно вносить в
небиологические объекты окружающей среды.
Этот способ может быть использован и в
отношении чумной вакцины, но концентрация
микробных клеток должна быть в 5-10 раз выше
по сравнению с подрощенным штаммом, т.к. не
все клетки обнаруживаются при экспрессном
исследовании.
4.8. Концентрация
микробных клеток в ампулах с живыми
вакцинами может колебаться в зависимости
от серии препарата. Определить ее с помощью
стандартного образца мутности не всегда
представляется возможным из-за цветовых
различий жидкости в разведенной вакцине и
стандарте. В этом случае определение
концентрации клеток для их дозированного
внесения в пробы возможно двумя
способами:
- содержимое ампулы
регидратируют до первоначального объема
дистиллированной водой, выдерживают
несколько часов, готовят ряд промежуточных
разведений и проводят непосредственный
подсчет микробных клеток одного из
разведений в камере Горяева. Концентрацию
клеток вычисляют математически с учетом
разведения;
- содержимое ампулы
разводят, как указано выше, и концентрацию
клеток рассчитывают математически, исходя
из того, что одна прививочная доза вакцины
должна содержать определенное количество
микробных клеток, обеспечивающих
необходимый иммунный ответ. Число
прививочных доз указано на ампуле, что
позволяет к определенному объему
разведенной вакцины (0,1 мл) добавить
расчетное количество физраствора для
получения необходимой концентрации
микробных клеток. Расчеты для некоторых
вакцин представлены
ниже.
---------------------T-------------T----------------T------------¬
¦Наименование вакцины¦ Количество ¦
Количество ¦ Получаемая ¦
¦
¦ м.к. в ¦ физраствора на
¦концентрация¦
¦ ¦
прививочной ¦одну прививочную¦м.к. в 1 мл
¦
¦ ¦ дозе ¦ дозу (мл) ¦
¦
+--------------------+-------------+----------------+------------+
¦
¦ 9 ¦ ¦ 9 ¦
¦Чумная - накожная ¦ 3,0 x 10 ¦ 0,3 ¦ 10
¦
+--------------------+-------------+----------------+------------+
¦
¦ 8 ¦ ¦ 9 ¦
¦Чумная - подкожная ¦ 3,0 x 10 ¦ 0,03 ¦ 10
¦
+--------------------+-------------+----------------+------------+
¦
¦ 10 ¦ ¦ 9 ¦
¦Бруцеллезная ¦ 1,33 x 10 ¦ 1,33 ¦ 10
¦
+--------------------+-------------+----------------+------------+
¦
¦ 8 ¦ ¦ 8 ¦
¦Сибиреязвенная ¦ 4,0 x 10 ¦ 0,4 ¦ 10
¦
+--------------------+-------------+----------------+------------+
¦
¦ 8 ¦ ¦ 8 ¦
¦Туляремийная ¦ 2,0 x 10 ¦ 0,2 ¦ 10
¦
L--------------------+-------------+----------------+-------------
Пример: в ампуле содержится 7 доз
бруцеллезной вакцины в 1 мл.
9
Для получения суспензии 1
млрд. (10 ) м.к./мл необходимо после
регидратации вакцины в 1 мл
дистиллированной воды отобрать из
ампулы 0,1 мл суспензии и добавить
физраствор в количестве 1,33 х
7 ~= 9,3 мл.
4.9. Инактивированная холерная
корпускулярная вакцина Эль-Тор
10 11
выпускается с
содержанием 8 x 10 и 1,6 х 10 м.к./мл. Для
9
получения суспензии 10
м.к./мл содержимое ампулы регидратируют
соответственно в 1,0 или в 2,0 мл
дистиллированной воды и к 0,1 мл
суспензии добавляют 7,9 мл физраствора.
4.10. Сибиреязвенная вакцина из штамма СТИ
как после регидратации, так и после
подращивания содержит конгломераты
споровых или переплетенные цепочки
вегетативных клеток. В связи с этим при
внесении небольших количеств имитатора в
пробу может оказаться, что при микроскопии
мазка во многих полях зрения светящиеся
клетки не будут обнаружены, а в каком-нибудь
одном поле встретится конгломерат из
многих клеток. Предупредить такое явление
могло бы тщательное разбивание хлопьев на
единичные клетки. Однако без специальной
обработки (например, ультразвуковой или
добавления поверхностно-активных веществ)
сделать это затруднительно. Крупные хлопья
частично можно разбить тщательным
пипетированием через узкий кончик
пастеровской пипетки или шприцом с тонкой
иглой, но мелкие комочки остаются. В таких
случаях избежать ложных отрицательных
результатов микроскопического
исследования можно за счет
предварительного просмотра мазков с
объективами х20, х40, позволяющими увеличить
размер полей зрения.
4.11. Выбор материала
для внесения ПБА и самих агентов не должны
противоречить условиям "легенды".
Нерационально, например, готовить
токсиносодержащую пробу на мембранном
фильтре или в "соскоб с карбункула" вносить
холерный вибрион. Некоторые из возможных
сочетаний наименований проб по легенде с
фактическим материалом представлены в
таблице. Используемый материал перед
внесением биологических агентов должен
быть или проверен на содержание
микроорганизмов (почва, трава, листья,
кровь, сыворотка крови, кал) или быть
стерильным (физраствор, тампоны, мембранные
фильтры, почва, кал, зерно, сено и
др.).
НЕКОТОРЫЕ МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
ПРОБ
---------T---------------------T---------------------------------¬
¦Объекты ¦Наименование пробы по¦
Используемый материал ¦
¦ ¦
легенде +----------------------T----------+
¦ ¦
¦ проба ¦объем, вес¦
+--------+---------------------+----------------------+----------+
¦Окру- ¦Смыв с поверхности ¦физраствор
¦5; 10 мл ¦
¦жающая ¦
+----------------------+----------+
¦среда ¦
¦тампон ¦ ¦
¦ ¦
+----------------------+----------+
¦ ¦
¦мембранный фильтр ¦ ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Фураж ¦зерно ¦2-5 г ¦
¦ +---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Подстилочный материал¦сено, солома
¦2-5 г ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Растения ¦трава, листья, хвоя ¦3-5 г
¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Воздух ¦физраствор ¦5; 10 мл
¦
¦ ¦
+----------------------+----------+
¦ ¦
¦мембранный фильтр ¦ ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Вода ¦вода ¦500 мл ¦
¦ ¦ +----------------------+----------+
¦
¦ ¦мембранный фильтр ¦
¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Осколок боеприпаса ¦физраствор ¦5
мл ¦
¦ ¦
+----------------------+----------+
¦ ¦
¦тампон ¦ ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Почва ¦почва, песок ¦10 г
¦
+--------+---------------------+----------------------+----------+
¦Биологи-¦Пунктат бубона ¦физраствор
¦1 мл ¦
¦ческие
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Смыв (соскоб) ¦физраствор ¦1 мл
¦
¦ ¦карбункула ¦ ¦
¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Смыв с судна ¦физраствор ¦5; 10 мл
¦
¦ ¦(с рвотными массами
+----------------------+----------+
¦ ¦и пр.)
¦тампон ¦ ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Смыв с носоглотки ¦физраствор ¦5; 10
мл ¦
¦ ¦
+----------------------+----------+
¦ ¦
¦тампон ¦ ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Кровь ¦кровь, сыворотка крови¦2-5
мл ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Раневое отделяемое ¦физраствор ¦1
мл ¦
¦ ¦
+----------------------+----------+
¦ ¦
¦тампон ¦ ¦
¦
+---------------------+----------------------+----------+
¦
¦Кал ¦кал в физрастворе ¦1 г; 5 мл
¦
¦ ¦
+----------------------+----------+
¦ ¦
¦тампон ¦ ¦
L--------+---------------------+----------------------+-----------
4.12.
При внесении в сухие пробы биологических
агентов в малом объеме жидкости происходит
быстрое ее высыхание, что приводит к
отмиранию микроорганизмов. Зерно в месте
попадания жидкости после ее высыхания
склеивается в плотный комок, требующий
тщательного растирания. При необходимости
сохранить биологические агенты в жидкой
фазе достаточно длительное время
целесообразно добавлять физиологический
раствор или вносить ПБА из менее
концентрированных исходных суспензий.
4.13. Рекомендуется добавлять жидкие
компоненты в пробы в следующей
очередности:
- физиологический раствор
в сухие пробы;
- диагностикумы, токсины и
инактивированные вакцинные штаммы;
-
условно-патогенные микроорганизмы;
-
живые вакцинные штаммы неспорообразующих
микроорганизмов;
- живые вакцинные
штаммы спорообразующих микроорганизмов.
Живые микроорганизмы одного вида можно
вносить одной пипеткой (одним
наконечником), начиная с меньших
концентраций.
4.14. Имитаторы различных
бактериальных агентов удобно вносить
5 9
в пробы из
исходных концентраций от 10 до 10 м.к./мл,
а
4
5
условно-патогенные микроорганизмы -
из концентраций 10 - 10
м.к./мл. В самой
пробе объемом 5 или 10 мл происходит
уменьшение
концентрации клеток
(разбавление суспензии) соответственно в 5
и
10 раз, а при усреднении пробы до 20 мл
происходит дополнительное
разбавление
суспензии соответственно в 4 и в 2 раза.
Все это
следует учитывать для расчета
количества микробных клеток не
только
при подготовке, но и при дальнейшем
исследовании проб. Так,
например, если
исходная концентрация кишечной палочки
составляет
5
10 м.к./мл (100 тыс.) и в
пробу вносится 50 мкл такой суспензии
3
(5,0 x 10 ) на 5 мл, то в 1 мл пробы
теоретически будет
3
2
содержаться 10 м.к./мл, а в
посевной дозе (0,1 мл) - 10 или 100
клеток.
Исходную суспензию можно вносить в пробу
каплями, исходя
из предположения, что
одна капля на конце тонкой пипетки
Пастера
равна 25 мкл. Этот метод
является более грубым, т.к. размер капли
в зависимости от густоты суспензии может
меняться. Применение
современных
механических и электронных пипеток и
пипеточных
дозаторов позволяет
проводить дозирование быстрее и точнее,
чем
капельное. Объемы исходной
суспензии, которые необходимо добавить
в пробы для получения требуемой
концентрации микробных клеток,
указаны
в Прилож. 1, которое дано в двух вариантах (1.1.
и 1.2.).
4.15. В качестве имитатора
ботулотоксина используют стандартный
препарат токсического комплекса
ботулинического токсина типа С (Прилож. 3, N
16). Случаи пищевого отравления токсином
типа С не отмечены, однако работа с
препаратом
