"лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. методические указания. мук 4.2.1887-04"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 04.03.2004)
Общая схема проведения исследования крови
представлена на рисунке 2 (не приводится).
8.1. Менингококковая инфекция.
8.1.1.
Характеристика возбудителя.
Возбудителем менингококковой инфекции
является менингококк (Neisseria meningitidis), который
относят к роду нейссерий, включенному
(согласно "Определителя бактерий Берджи") в
состав 4-й группы микроорганизмов,
озаглавленной как " Грамотрицательные,
аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки".
Морфологически клетки менингококков имеют
округлую форму и размеры порядка 0,6-1,0 мкм.
Величина микробных клеток и их форма могут
различаться, что определяет характерный
для менингококков признак клеточного
"полиморфизма". Этот признак особенно
выражен в мазках из свежих культур, при этом
общая морфологическая картина
культурального мазка, окрашенного по Граму,
имеет вид лежащих беспорядочно полиморфных
(по величине и окраске) грамотрицательных
кокков (эффект "рассыпанного гороха").
Парное расположение менингококков
(диплококков) наблюдают в препаратах,
приготовленных из жидкостей и органов
пораженного организма. В спинномозговой
жидкости менингококки часто располагаются
внутрилейкоцитарно и имеют форму кофейного
зерна.
Антигенная структура
менингококка сложна и включает капсульный
полисахарид, липополисахарид, пили, белки
наружной и внутренней мембран клеточной
стенки. Современными исследованиями
показана возможность менингококков
самостоятельно секретировать в окружающую
среду ряд антигенов (например,
иммуноглобулин A 1 - протеаза), которые
играют ведущую роль в формировании
вирулентных свойств менингококков.
Менингококки неподвижны, спор не образуют,
жгутиков не имеют, являются строгими
аэробами, чрезвычайно чувствительны к
воздействию внешней среды. Температурный
оптимум жизнедеятельности - 37 град. C в
атмосфере с повышенным содержанием CO2 (5-10%) и
влажности. Менингококки нуждаются в
высокопитательных средах, содержащих
нативные белки или кровь животного
происхождения. При росте на плотных
питательных средах образуют небольшие,
слегка выпуклые, полупрозрачные колонии с
идеально ровными краями. При выдерживании
посевов в термостате в течение 2-5 дней
колонии увеличиваются в размере,
становятся менее прозрачными и края их
приобретают неровный вид. Биохимическая
активность менингококков невелика и из
числа многих углеводов они ферментируют
только глюкозу и мальтозу с образованием
кислоты без газа, не разжижают желатин,
оксидазоположительны,
каталазоположительны. В соответствии с
особенностями строения полисахаридной
капсулы менингококки подразделяют на 12
серогрупп: A, B, C, X, Y, Z, W-135, 29-Е, K, H, L, I. Особое
эпидемиологическое значение имеют
менингококки серогрупп A, B, C, которые
способны вызывать эпидемии и наиболее
часто выделяются от больных
генерализованными формами менингококковой
инфекции. Другие серогруппы могут вызывать
заболевания, но чаще выделяются из
носоглотки носителей.
Определение
серогрупповой характеристики
менингококков является важнейшей
составляющей в системе
эпидемиологического надзора за
менингококковой инфекцией. Существующие
современные классификации менингококков
по различным антигенным системам (белки,
липополисахариды, пили и другие) позволяют
определять их популяционные особенности и
отбирать наиболее иммуногенные компоненты
для конструирования вакцинных препаратов
нового поколения.
8.1.2. Лабораторная
диагностика генерализованных форм
менингококковой инфекции.
Диагностику
генерализованных форм менингококковой
инфекции проводят в соответствии с общей
схемой исследования материала при гнойных
бактериальных менингитах. Лабораторное
подтверждение ГФМИ и выявление
менингококков выполняют по следующим
тестам:
- обнаружение в нативном
материале диплококков с характерными
морфологическими признаками;
-
характерный рост только на
высокопитательных средах;
- типичная
морфология культурального мазка по
Граму;
- сахаролитическая активность в
отношении глюкозы и мальтозы;
-
выявление группоспецифических свойств;
- обнаружение специфических антигенов в
ликворе и/или сыворотке крови в реакциях
латекс-агглютинации и ВИЭФ
(экспресс-методы);
- детекция
специфических антител в сыворотке крови в
реакции РНГА.
При бактериоскопии
нативного ликвора или препарата крови
"толстая капля" (окраска водно-спиртовым
раствором метиленовой сини) на голубом фоне
обнаруживают морфологически четкие
окрашенные в темно-синий цвет кокки,
диплококки, напоминающие кофейные зерна
или семена бобов, прилегающие друг к другу
вогнутыми сторонами, иногда выявляют
капсулу. Микробные клетки могут
располагаться как вне- так и
внутрилейкоцитарно. Интенсивность
обсеменения СМЖ микробными клетками
колеблется в значительных пределах и
зависит от стадии развития инфекционного
процесса в момент взятия материала. Если
осуществлялось лечение антибиотиками,
типичная морфология микробных клеток
теряется.
При посеве на питательные
среды и дальнейшей инкубацией в течение 24
часов при 37 град. C в атмосфере с 5-10% CO2 и
повышенной влажностью проявляются
следующие тинкториальные свойства:
- на
полужидкой питательной среде (0,1%
полужидкий сывороточный агар) менингококки
вызывают интенсивное помутнение в верхней
части столбика среды;
- на "двухфазной"
питательной среде при посеве крови
отмечают помутнение жидкой фазы и рост
полупрозрачных сероватых колоний на
границе плотной и жидкой фаз;
- на чашках
с "шоколадным" агаром менингококки растут в
виде нежных полупрозрачных сероватых
колоний с идеально ровными краями, с
блестящей поверхностью, размером 1-2 мм.
Имеют маслянистую консистенцию, не меняют
цвета среды, не имеют запаха. С увеличением
времени культивирования тинкториальные
свойства меняются;
- на чашках с
сывороточным агаром менингококки растут в
виде полупрозрачных, нежных голубоватых
колоний с ровными краями и гладкой
блестящей поверхностью;
- на чашках без
добавления нативных сыворотки и крови
животного происхождения, так же на чашках с
добавлением желчи менингококки не
растут.
При определении
сахаролитической активности проводят учет
результатов посева чистой культуры на
плотные питательные среды с углеводами.
Метод дает возможность дифференцировать
различные виды нейссерий и некоторые
другие виды микроорганизмов (таблица
3).
Таблица 3
Сахаролитическая
активность
Neisseria и
Moraxella
---------------T-------------------------------------------------¬
¦ Вид ¦ Сахара
¦
¦
+-----------T-----------T------------T------------+
¦ ¦
глюкоза ¦ мальтоза ¦ лактоза ¦ сахароза
¦
+--------------+-----------+-----------+------------+------------+
¦N.meningitidis¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦
+--------------+-----------+-----------+------------+------------+
¦N.gonorrhoeae ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+--------------+-----------+-----------+------------+------------+
¦N.sicca ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦
+--------------+-----------+-----------+------------+------------+
¦N.lactamica ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦
+--------------+-----------+-----------+------------+------------+
¦M.catarrhalis ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
L--------------+-----------+-----------+------------+-------------
Менингококки
ферментируют глюкозу и мальтозу с
образованием кислоты. Иногда наблюдают
вариабельность сахаролитической
активности у различных штаммов одного и
того же вида. Для уточнения биохимических
свойств менингококков используют
тест-системы, разрешенные к применению для
этих целей в Российской Федерации в
установленном порядке. Тест-системы
позволяют провести расширенное изучение
ферментативной и метаболической
активности менингококков (по 13 параметрам и
более) и в течение 2-х часов определить
видовую принадлежность возбудителя.
Определение серогруппы у менингококков
проводят в реакции агглютинации на стекле с
набором агглютинирующих серогрупповых
антисывороток (серогруппы A, B, C, X, Y, Z, W-135, 29E),
разрешенных к применению для этих целей в
установленном порядке в Российской
Федерации. Реакцию проводят только с чистой
культурой менингококков, с успехом
прошедшей все этапы идентификации.
Менингококки серогрупп A, B и C наиболее
часто являются причиной возникновения
генерализованных форм менингококковой
инфекции. Поэтому в первую очередь с
антисыворотками к менингококкам этих
серогрупп выполняют реакцию агглютинации.
На предметное стекло, разделенное маркером
на три части, наносят физиологический
раствор (по капле на каждую часть). Далее
стерильной петлей, деревянной палочкой или
любым другим аппликатором с поверхности
агаровой среды снимают культуру
менингококков и тщательно растворяют в
каплях физиологического раствора на
стекле. После этого, если не выявлено
спонтанной агглютинации с физиологическим
раствором, в три подготовленные части
добавляют антисыворотки A, B и C (по капле) и
перемешивают. Учет реакции проводят через
1-2 минуты. Образование крупных хлопьев на
фоне полного просветления
агглютинационного поля указывает на
положительную реакцию специфического
взаимодействия антигена и антитела и
позволяет определить серогруппу
менингококков. Отсутствие реакции с одной
из основных серогрупповых антисывороток,
указывает на необходимость продолжения
проведения аналогичных исследований с
другими специфическими антисыворотками (X,
Y, Z, W-135, 29Е). Только в том случае, если
подтвержденный всеми тестами штамм
менингококка не показал положительного
результата в реакции агглютинации с полным
набором агглютинирующих антисывороток, его
следует отнести к категории
неаггютинирующегося штамма (НА).
Экспресс-методы. Реакцию
латекс-агглютинации с нативным ликвором
(экспресс-метод) проводят при наличии в нем
признаков гнойного воспаления и/или при
бактериоскопическом обнаружении
возбудителей. Использование реакции
позволяет в кратчайшие сроки (15-20 минут)
выявить специфические антигены
менингококков самых распространенных
серогрупп (A, B, C, Y, W-135). Реакцию выполняют с
помощью наборов, разрешенных к применению
для этих целей в Российской Федерации в
установленном порядке, согласно инструкции
по применению. Реакция встречного
иммуноэлектрофореза (экспресс-метод)
позволяет с помощью специфических
антисывороток (преципитирующих) к
различным серогруппам менингококков в
течение 30 минут выявлять полисахаридный
антиген возбудителя в СМЖ и сыворотках
крови, взятых у больных в первый день
поступления в стационар.
Реакция
непрямой гемагглютинации с "парными"
сыворотками крови выявляет динамику
нарастания титров специфических антител к
менингококку и позволяет определить
принадлежность возбудителя к наиболее
распространенным серогруппам
менингококков (A и C). Использование метода
дает возможность провести ретроспективную
лабораторную диагностику генерализованных
форм менингококковой инфекции, так как
окончательный ответ получают только через
12-14 дней после начала заболевания.
Преимущественными возможностями метода
является лабораторное подтверждение
менингококкцемии, при которой
использование других методов лабораторной
диагностики, как правило, мало эффективны.
Характеристика эритроцитарных
менингококковых диагностикумов, условия их
хранения и техника постановки реакции
непрямой (пассивной) гемагпотинации
изложены в инструкциях по применению
препаратов.
8.1.3. Лабораторная
диагностика менингококковых
назофарингитов и бактерионосительства.
Подробная схема проведения исследования
представлена на рисунке 3 (не приводится).
Окончательным этапом является
серогруппирование менингококков и
определение чувствительности к
антибактериальным препаратам.
8.1.4.
Чувствительность менингококков к
антибактериальным препаратам.
Менингококки остаются
высокочувствительными к пенициллину,
который является основным лекарственным
препаратом при лечении больных
генерализованными формами менингококковой
инфекции. Несмотря на то, что в зарубежной
печати появляются сообщения об обнаружении
менингококков со сниженной
чувствительностью к пенициллину,
длительные динамические наблюдения за
российскими штаммами менингококков не
выявили резистентных и умеренно
резистентных штаммов. Современная тактика
проведения исследований по определению
чувствительности менингококков к
антибактериальным препаратам
предусматривает применение только тех
методов, которые позволяют определять
минимальную подавляющую концентрацию (МПК)
антибактериального препарата, при этом
рекомендуется использовать методы
серийных разведений в агаре или в бульоне и
метод Е-тестов. Диско-диффузионный метод не
используется для достоверного определения
чувствительности менингококков к
антибактериальным препаратам из-за
трудностей по интерпретации результатов.
Наиболее широкое распространение в
современных условиях получил
количественный метод Е-тестов.
Для
выполнения процедуры требуются: чашки с
питательной средой Мюллер-Хинтон с 5% крови
барана, бактериальная суспензия
менингококков мутностью 0,5 по стандарту
МакФарланд, стрипы Е-тестов
бензилпенициллина, цефотаксима,
цефтриаксона, хлорамфеникола,
доксициклина, рифампицина и триметоприма.
Бактериальную суспензию менингококков
мутностью 0,5 по стандарту МакФарланд
засевают на чашки с использованием ватного
тампона. Тампон смачивают в суспензии,
несколько отжимают о стенки пробирки и
далее проводят посев путем тщательного
втирания содержащейся в тампоне
бактериальной массы в поверхность
питательной среды. Е-тесты осторожно
накладывают на поверхность чашки.
Количество стрип на одной чашке определяют
ее диаметром. На обычной чашке диаметром 90
мм можно наложить только 2 стрипа, поэтому
целесообразнее пользоваться чашками Петри
большего диаметра (150 мм), применение
которых позволяет наложить 5 стрипов. Чашки
инкубируют при 37 град. C с 5% CO2 в течение 24-х
часов и затем проводят учет результатов.
Учитывая то, что стрипы Е-тестов содержат на
своей поверхности различные концентрации
антибактериального препарата, возможно
определение той минимальной подавляющей
концентрации (мкг/мл), которая еще лизирует
бактериальную субстанцию. Оценку
результатов проводят по таблице
4.
Таблица 4
Критерии интерпретации
результатов определения
чувствительности менингококков к
антибактериальным
препаратам методом
Е-тестов
(мкг/мл)
-----------------T-----------------------------------------------¬
¦ Критерии ¦ Антибактериальные
препараты ¦
¦чувствительности+------T-----T------T------T-------T-----T------+
¦ ¦ PG ¦ CT ¦ CTX ¦ CL ¦ DC ¦ RI ¦ TS
¦
+----------------+------+-----+------+------+-------+-----+------+
¦
S ¦<0,06 ¦<0,5 ¦<0,25 ¦ <8 ¦ <0,25 ¦ <1 ¦
<2 ¦
+----------------+------+-----+------+------+-------+-----+------+
