"лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. методические указания. мук 4.2.1887-04"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 04.03.2004)

лаборатории. Допустимым условием хранения емкостей с питательными средами является температура бытового холодильника (+4 град. C). Срок хранения - не более 7 дней. Перед пункцией емкости с питательными средами достают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 10 минут. После проведения пункции непосредственно из пункционной иглы выполняют посев СМЖ на чашку с "шоколадным" агаром. Чашку осторожно открывают и на поверхность среды закапывают несколько капель ликвора (3-4 капли). Далее чашку закрывают, ставят на ровную поверхность и с помощью нескольких круговых движений чашки по поверхности стола капли ликвора распределяют по поверхности агара. После того как СМЖ впитается (обычно 2-3 минуты) необходимо зафиксировать дно и крышку чашки (например пластырем) для того, чтобы не возникло ее случайного открытия. Посев СМЖ в пробирку с 0,1% полужидким сывороточным агаром проводят сразу после пункции. Для этого непосредственно из пункционной иглы 5-6 капель СМЖ вносят в пробирку с 0,1% полужидким сывороточным агаром. Следует указать на то, что если непосредственно у постели больного сделан посев СМЖ по вышеизложенному способу, то этап посева нативной СМЖ в лаборатории следует исключить, при этом доставленную в лабораторию стерильную СМЖ исследуют только бактериоскопическими и серологическими методами. Емкости с посевами до доставки в лабораторию хранят в условиях термостата при 37 град. C или немедленно доставляют в бактериологическую лабораторию. В бактериологической лаборатории посевы инкубируют при 37 град. C в течение 24-48 часов в атмосфере, содержащей 5-10% CO2 (эксикатор со свечой, CO2-инкубатор). При наличии роста на плотных питательных средах проводят визуальную оценку выросших колоний, готовят мазок по Граму, определяют оксидазу, каталазу и в зависимости от полученного результата проводят дальнейшую идентификацию возбудителя и определение чувствительности к антибиотикам. При наличии признаков роста в 0,1% полужидком сывороточном агаре проводят высев на чашки с "шоколадным" агаром.
Культивацию посевов и дальнейший ход исследований проводят так же как описано выше.
7.2.2. Бактериологический посев крови.
Посев крови выполняют во флаконы с "двухфазной" питательной средой в соотношении крови к жидкой фазе 1:10 для уменьшения бактерицидного эффекта человеческой сыворотки. "Двухфазная" питательная среда содержит X, V факторы роста и витамины. На ней хорошо растут менингококки, пневмококки, гемофильные палочки и другие менее требовательные к составу питательной среды микроорганизмы.
Представляется перспективным использование готовых "двухфазных" сред для посева крови, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке. Эти среды сбалансированы по питательным свойствам, обогащены различными ростовыми добавками, содержат вещества, инактивирующие действие сыворотки крови и антибиотиков, имеют оптимальный газовый состав.
Засеянную в отделении кровь доставляют в лабораторию и инкубируют в течение 5 суток при температуре 37 град. C. Посевы ежедневно просматривают на наличие микробного роста. Признаками микробного роста на "двухфазной" среде служит помутнение жидкой среды, наличие хлопьевидного осадка, газообразование, образование пленки. Часто изменения "жидкой" фазы среды сопровождаются ростом колоний на "плотной" фазе среды.
В связи с тем, что рост некоторых микробов не приводит к визуально заметным изменениям прозрачности и цвета жидкой фазы питательной среды рекомендуется выполнить посев на "шоколадный" агар через 48 часов инкубации, даже, несмотря на отсутствие признаков микробного роста во флаконе. При отрицательном результате посева следует продолжить инкубирование флакона.
В случае обнаружения роста микроорганизмов в "двухфазной" питательной среде, флакон вскрывают и из бульона или выросших на твердой фазе колоний готовят мазок, окрашенный по Граму. По результатам микроскопии выполняют высев на чашки с "шоколадным" агаром для выделения менингококков, пневмококков и гемофильных палочек типа "b". В других случаях, в соответствии с данными бактериоскопического исследования к указанному набору сред добавляют любые адекватные питательные среды (желточно-солевой агар, среда Эндо, среда Сабуро и др.) для выделения и идентификации "прочих" возбудителей ГБМ.
После получения роста микроорганизмов на плотных средах из выросших колоний готовят мазок по Граму, определяют оксидазу, каталазу и проводят дальнейшую биохимическую, серологическую идентификацию, определяют чувствительность к антибиотикам.
7.2.3. Бактериологический посев носоглоточной слизи.
Посев выполняют немедленно после забора материала или после доставки материала в лабораторию на чашки с сывороточным агаром и на чашки с селективным сывороточным агаром (в качестве селективной добавки используют линкомицин). Материал засевают путем втирания тампона на четверть чашки. Оставшуюся часть агара на чашке засевают штриховым методом с помощью стерильной бактериологической петли. Засеянные чашки инкубируют в условиях термостата при 37 град. C в течение 24-х часов. При обнаружении колоний, визуально сходных с ростом менингококков, выполняют отсев на чашки с сывороточным агаром. После культивирования посевов в условиях термостата при 37 град. C из выросших колоний готовят мазок по Граму в модификации Калины, определяют оксидазу, каталазу и проводят дальнейшую идентификацию.
7.3. Реакция латекс-агглютинации (экспресс-метод).
Наиболее простым методом, не требующим сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, является метод латекс-агглютинации, позволяющий в течение 15 минут дать заключение об отсутствии или наличии в СМЖ больного специфических антигенов. Реакцию проводят при наличии признаков гнойного воспаления в ликворе и/или при бактериоскопическом обнаружении в нем возбудителей. Предварительно СМЖ необходимо прогреть в течение 5 минут при 100 град. C и отцентрифугировать при 1500-2000 об/мин. Для проведения реакции используют прозрачную надосадочную жидкость. Одну каплю каждого латексного реактива (предварительно реактивы рекомендуется тщательно встряхнуть) наносят на специальные бумажные карты, приложенные к набору. Затем добавляют 30 мкл СМЖ (надосадочная фракция) к каждой капле латексного реактива. Перемешивают чистым аппликатором. Осторожно покачивают бумажную карту. Агглютинация в течение 2-х минут с одним из латекс-диагностических препаратов свидетельствует о присутствии в испытуемом образце специфического антигена. Для выполнения реакции используют наборы латекс-диагностических препаратов, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
7.4. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ - экспресс-метод).
Реакция позволяет с помощью специфических антисывороток выявлять полисахаридный антиген возбудителя в СМЖ и сыворотке крови больного уже в первый день исследования материала. Для проведения реакции необходимы: проба СМЖ (осадок, если ликвор мутный) и/или сыворотка крови, преципитирующие антисыворотки, веронал-мединаловый буфер, 1% агар на веронал-мединаловом буфере, любой аппарат для иммуноэлектрофореза, стеклянные пластины размером 9x12 см, трафареты, пробойники для агара, отсасывающие агар устройства, пастеровские пипетки или дозаторы с наконечниками, фильтровальная бумага, предметный столик или другой объект с идеально ровной поверхностью.
В аппарат для иммуноэлектрофореза заливают веронал-мединаловый буфер, содержащий в 1 литре дистиллированной воды 21,9 грамм мединала и 3,35 грамм веронала (веронал предварительно нагревают на водяной бане в небольшом количестве дистиллированной воды до полного растворения). Измеряют рН и доводят его до уровня 8,6. Далее на веронал-мединаловом буфере (предварительно развести дистиллированной водой в 4 раза) готовят 1% агар. На 100 мл буфера добавляют 1 грамм агара, нагревают на водяной бане до полного растворения и в горячем, но несколько охлажденном виде (температура 60-70 град. C) в количестве 20 мл наносят на стеклянные пластины размером 9x12 см. Пластину предварительно помещают на ровную горизонтальную поверхность. После застывания агара специальным пробойником или металлической трубкой с диаметром 3 мм высекают два параллельных ряда отверстий по длине стекла на расстоянии 3 мм друг от друга.
Специфические антисыворотки вносят в лунки агара со стороны анода (+), а испытуемую пробу СМЖ и/или сыворотку крови - со стороны катода (-). В отдельные лунки помещают положительный контроль. В качестве положительного контроля используют антигенный препарат (полисахарид) и гомологичную антисыворотку. Подготовленную пластину помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза, соединяют стекло и буфер с помощью фильтровальной бумаги и включают аппарат в сеть. Время экспозиции 20-30 минут при силе тока 12 миллиампер. Результат учитывают через 10 минут после выключения аппарата. Реакцию считают положительной, если между лунками проявляются четкие линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. Рекомендуется проведение повторного и окончательного учета результатов реакции через 24 часа, при этом стекла хранят во влажной камере или в эксикаторе с влажной атмосферой.
7.5. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).
Исследование сыворотки больного в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации является вспомогательным методом диагностики менингококковой инфекции и позволяет существенно увеличить процент лабораторного подтверждения генерализованных форм менингококковой инфекции. Для получения достоверного результата обязательным условием является исследование сывороток крови больного в динамике, т.е. взятых в разные сроки заболевания (на 1-й и 10-12-й дни болезни).
В соответствии с приказом Минздрава России N 375 от 23 декабря 1998 года "О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов" РНГА можно выполнять как макро- так микрометодом с соблюдением соотношения ингредиентов.
Одной из модификаций микрометода является постановка РНГА в полистироловых пластинах с объемом лунок не менее 300 мкл с использованием автоматических дозаторов на 50 мкл и 100 мкл.
Необходимые реагенты: диагностикумы эритроцитарные менингококковые полисахаридные серогрупп A и C; исследуемая сыворотка, разведенная 1:5; забуференный физиологический раствор (ЗФР).
Приготовление ЗФР: в 0,5 л дистиллированной воды растворяют NaCl - 8,65 г, Na2HPO4 12H2O - 1,92 г, KH2PO4 - 0,44 г. Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой и проверяют рН раствора, который должен быть равен 7,2.
Ход исследования: два ряда полистироловой пластины (для выявления антител к менингококкам серогрупп A и C) заполняют по 100 мкл ЗФР, затем проводят двукратное титрование исследуемой сыворотки с разведения 1:5. В каждый ряд добавляют по 50 мкл соответствующего диагностикума. Пластину встряхивают и помещают в термостат на 2-2,5 часа при 37 град. C, после чего учитывают результаты. Обязательными контролями служит отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума и исследуемой сыворотки. Для этого к 100 мкл диагностикума добавляют 50 мкл ЗФР, а к 100 мкл сыворотки - 50 мкл 1% эритроцитов барана. Учет результатов РНГА проводят по четырехкрестной системе. Условно-диагностическим титром антител при ГФМИ считают разведение 1:40. Четырехкратное и более нарастание титра специфических антител в процессе болезни начиная с 1:40 и выше служит подтверждением диагноза.
7.6. Методы определения лекарственной чувствительности.
Методы определения чувствительности микроорганизмов подразделяют на методы серийных разведений и диффузные методы. Методы серийных разведений в бульоне и агаре основаны на прямом воздействии антибактериального препарата (АБП) и количественном определении минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика по отношению к исследуемому микроорганизму. Их чаще используют при проведении научно-исследовательских работ.
Диффузионные методы основаны на подавлении роста исследуемой культуры при диффузии из носителя антибактериального препарата в плотную питательную среду. Существуют две модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.
Диско-диффузионный метод - качественный метод. Он позволяет отнести по степени чувствительности к антибиотику исследуемый микроорганизм к чувствительным, умеренно устойчивым и устойчивым штаммам. Благодаря простоте исполнения он является основным для практических лабораторий. Е-тест - количественный метод, непосредственно определяющий МПК антибиотика. Показания для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП, практическое использование методов подробно отражено в методических указаниях по контролю МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".
Распространение получили тест-системы для определения лекарственной чувствительности, в основе которых лежит метод микроразведений антибиотиков. Это позволяет стандартизировать подготовительные этапы исследования, оценивать результат визуально или с применением различных автоматизированных систем. Одной из разновидностей метода серийных разведений является метод, основанный на использовании двух концентраций антибиотика соответствующих пограничным значениям МПК. Такая тест-система представляет собой пластиковую полоску с расположенными на ней двумя рядами лунок. Каждый антибактериальный препарат представленный на полоске в первой лунке содержит "малую" пороговую концентрацию лиофилизированного антибиотика, а во второй лунке "большую" пороговую концентрацию. Первая пара лунок не содержит антибиотик и служит для контроля роста исследуемой культуры. Последняя пара лунок нужна для дополнительного тестирования культуры на чувствительность к препаратам не входящим в набор системы. Результат оценивают по наличию или отсутствию мутности (роста) в лунках. Наличие роста в лунках с "малой" и "большой" концентрацией антибиотика свидетельствует о резистентности культуры к данному антибиотику. Наличие роста в лунке с "малой" концентрацией препарата и отсутствием роста в лунке с "большой" концентрацией - указывает на умеренную устойчивость штамма. Отсутствие роста в обеих лунках позволяет отнести исследуемую культуру к чувствительным штаммам. Представляется перспективным использование тест-систем для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
8. Лабораторная диагностика менингококковой
инфекции и гнойных бактериальных менингитов
Специфические клинические проявления генерализованных форм менингококковой инфекции и гнойного бактериального менингита являются обоснованием для проведения соответствующего обследования больного при поступлении его в стационар. Приоритетным при этих заболеваниях является комплексное исследование СМЖ и крови. Общая схема проведения исследования ликвора представлена на рисунке 1 (не приводится).

"очистка, дезинфекция и стерилизация эндоскопов и инструментов к ним. методические указания. му 3.5.1937-04"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 04.03.2004)  »

Медицинское законодательство »