"лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. методические указания. мук 4.2.1887-04"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 04.03.2004)
интенсивных терапевтических и
реанимационных мероприятий, высокими
показателями летальности, развитием
резидуальных явлений, нередко приводящим к
тяжелой инвалидизации больных. От 50% до 80%
больных при поступлении в стационар
направляются в реанимационные отделения.
Летальность среди детей до года и лиц
пожилого возраста старше 65 лет достигает от
40% до 70%. Более трети переболевших страдают
цереброгенными астено-вегетативными
расстройствами, неврологическими и
психическими дефицитами различной степени
тяжести.
Пневмококковые менингиты не
входят в перечень инфекций, подлежащих
обязательной регистрации в Российской
Федерации, учет заболеваний проводится
только на отдельных территориях. По данным,
полученным Российским центром по
эпидемиологическому надзору за
менингококковой инфекцией и гнойными
бактериальными менингитами уровень
заболеваемости пневмококковыми
менингитами в 2001-2003 годы (г. Москва) составил
0,8 на 100 тыс. населения. Доля взрослых старше
25 лет в структуре заболевших составляла 80%.
Общая летальность определялась на уровне 29%
(среди детей до 14 лет - 9%, взрослых - 31,7%).
Показатели смертности составили 0,23 на 100
тыс. населения (среди детей до 14 лет - 0,05 на 100
тыс., среди взрослых - 0,27 на 100 тыс.
населения).
Пневмококковые менингиты,
как правило, являются следствием вторичной
локализации S.pneumoniae, и осложняют течение
пневмонии, отита, синусита и других
гнойно-септических заболеваний. В тех
случаях, когда определить первичную
локализацию пневмококковой инфекции не
удается, говорят о первичном
пневмококковом менингите. Инфицирование
оболочек и вещества головного мозга чаще
всего происходит гематогенным путем, но
возможно распространение возбудителя в
результате непосредственного перехода из
гнойных очагов расположенных вблизи
оболочек мозга (гнойный отит или гайморит),
либо путем метастазирования из более
отдаленных очагов (абсцесс легкого), либо в
результате травмы. Фоном для развития
пневмококкового менингита служат острые
респираторные заболевания, грипп и другие
простудные заболевания.
По капсульным
полисахаридам пневмококки разделены на 90
серотипов, имеющих различное
эпидемиологическое значение. Из наиболее
опасных серотипов приготовлены
пневмококковые вакцины, использующиеся для
вакцинации групп риска. В группы риска в
первую очередь входят дети в возрасте до
года и лица пожилого возраста старше 65 лет,
лица, имеющие в анамнезе хронические
заболевания сердца, легких, печени
(особенно у больных алкоголизмом), почек,
эндокринную патологию, сахарный диабет,
гематологические, онкологические
заболевания, черепно-мозговые травмы,
ликворею, иммунодефициты различного
генеза.
Гнойные бактериальные
менингиты, вызванные "прочими"
этиологическими агентами, отличаются своей
мозаичностью по этиологическому признаку и
особенно часто встречаются у новорожденных
детей. В неонатальный период (от рождения до
2-х месяцев) преобладающими этиологическими
агентами бактериальных менингитов
являются бактерии семейства Enterobacteriaceae:
Esherichia coli, Salmonella spp., Citrobacter spp. Значимыми
возбудителями в этой возрастной категории
являются Streptococcus agalactiae (группа B) и Listeria
monocytogenes. С возрастом соотношение
этиологических агентов меняется и
основными возбудителями становятся
менингококки, пневмококки и гемофильные
палочки типа "b", каждый из которых может
занимать лидирующее положение в
зависимости от времени наблюдения,
эпидемиологической ситуации,
территориальных особенностей и многих
других причин. Удельный вес так называемых
"прочих" этиологических агентов по данным
Российского центра по эпидемиологическому
надзору за менингококковой инфекцией и
гнойными бактериальными менингитами
составляет 5% от общего числа этиологически
подтвержденных случаев. Так, из 1999
бактериологически расшифрованных случав,
количество бактериальных менингитов,
обусловленных "прочими" возбудителями было
равно 97, при этом выявлено 17 различных
этиологических агентов, среди которых: Candida
albicans - 22,7%, Staphylococcus aureus - 17,5%, Streptococcus pyogenes - 14,4%,
Streptococcus agalactiae - 10,3%, Escherichia coli - 7,2%, Listeria
monocytogenes - 7,2%, Klebsiella pneumoniae - 6,2%, Pseudomonas aeruginosa -
4,1% и другие в единичных случаях.
Таким
образом, главная особенность гнойных
бактериальных менингитов -
полиэтиологичность возбудителей, которые
относятся к разным таксономическим
категориям и требуют неоднозначных
методических приемов при лабораторной
идентификации возбудителей.
4. Основные
принципы лабораторной диагностики
менингококковой инфекции и гнойных
бактериальных менингитов
Основные
принципы лабораторной службы по
этиологической расшифровке гнойных
бактериальных менингитов и подтверждению
клинического диагноза базируются на
особенностях самого заболевания:
-
тяжелейший симптомокомплекс клинических
проявлений в первые дни болезни указывает
на необходимость экстренного
незамедлительного проведения исследований
по определению этиологии заболевания с
обязательным использованием методов
экспресс-диагностики;
- ответ должен
быть не только быстрым, но и безошибочно
точным. Это чрезвычайно актуально для ГБМ,
так как заболевания полиэтиологичны по
своей природе. Данное обстоятельство
необходимо учитывать при организации
работы лабораторий по этиологической
расшифровке заболеваний. Показано, что
практически любой микроорганизм может быть
причиной бактериального менингита, но
основных возбудителей три. Это
менингококки, пневмококки и гемофильные
палочки типа "b", отвечающие за 85-90% от общего
числа расшифрованных случаев. На выявление
этих основных возбудителей и должны быть
направлены все силы и средства лабораторий,
занимающихся исследованием материала от
больных с подозрением на бактериальный
менингит;
- учитывая то, что очагом
воспаления являются мягкие мозговые
оболочки головного мозга и спинной мозг,
основным материалом для исследования
является спинномозговая жидкость (СМЖ).
Кроме того, из-за возникающей генерализации
процесса обязательным объектом
исследования является и кровь.
Исследование носоглотки для подтверждения
клинического диагноза ГФМИ представляется
нецелесообразным и, если исследование все
же проводят и при этом из носоглотки
выделяют менингококки, то расценивать
данный факт необходимо как выявление
локализованных форм - назофарингита (если
есть клинические признаки воспаления в
носоглотке) или носительства (если нет
клинических признаков локализованного
воспаления).
Теоретическое обоснование
подходов к лабораторной диагностике
бактериальных менингитов (в том числе и
генерализованных форм менингококковой
инфекции) следует сочетать с адекватной
практической составляющей. Основой
рутинного алгоритма ежедневной работы
являются специальные требования к объему
патологического материала подлежащего
исследованию и комплексное
методологическое оснащение
исследований.
5. Отбор материала для
исследования
Основным биологическим
материалом для исследования при
бактериальных менингитах служит
спинномозговая жидкость и кровь. Для
бактериологического подтверждения
менингококкового назофарингита и
выявления назофарингеального
менингококкового носительства исследуют
носоглоточную слизь.
5.1. Спинномозговая
жидкость.
Спинномозговую жидкость
отбирают у больного при пункции в объеме
2,0-5,0 мл на этапе поступлении в стационар до
начала антибиотикотерапии с соблюдением
правил асептики. Ликвор после пункции
распределяют для исследования следующим
образом:
- 1,0 мл направляют в клиническую
лабораторию для проведения общего
ликворологического и цитологического
исследования;
- 0,2 мл направляют для
постановки полимеразной цепной реакции,
которую выполняют в лабораториях,
специально оснащенных всем необходимым для
проведения такого рода исследований и
имеющих разрешение на данный вид
деятельности в установленном порядке;
-
1,0 мл направляют для первичного
бактериологического посева (если не сделан
в отделении при пункции), бактериоскопии и
серологических исследований;
- 0,5 мл
засевают в чашку с "шоколадным" агаром
непосредственно у постели больного. Далее
чашку хранят в условиях термостата при 37
град. C до доставки в лабораторию.
Применение данной методики позволяет
получить культуру возбудителя
бактериального менингита на 18-24 часа
раньше, чем по стандартной схеме посева
материала в лаборатории и, тем самым,
ускорить проведение исследования и выдачу
ответа;
- 0,5 мл ликвора засевают в среду
обогащения (в 5,0 мл 0,1% полужидкого
питательного агара) непосредственно у
постели больного и далее хранят при 37 град. C
в условиях термостата до доставки в
лабораторию.
5.2. Кровь.
Кровь
отбирают из вены при поступлении больного в
стационар с соблюдением правил асептики и
до начала антибиотикотерапии. Образцы
распределяют следующим образом:
- для
бактериологического посева на
гемокультуру отбирают - 5,0-10,0 мл крови у
взрослых; 2,0-5,0 мл - у детей и 1,0-2,0 мл - у
новорожденных и детей неонатального
периода;
- 3,0-5,0 мл крови используют для
серологических исследований с целью
выявления специфических антигенов
(встречный иммуноэлектрофорез - ВИЭФ) и
специфических антител (реакция непрямой
гемагглютинации - РНГА). Для получения
достоверных результатов о нарастании
титров антител в реакции РНГА важно
исследовать парные сыворотки, т.е.
сыворотки крови, взятые в первые дни
болезни при поступлении больного в
стационар и затем на 10-12 день
заболевания;
- несколько капель крови
наносят на предметное стекло для
приготовления препарата "толстой капли"
крови.
5.3. Назофарингеальная слизь.
Назофарингеальную слизь с задней стенки
глотки берут натощак или через 3-4 часа после
еды стерильным ватным тампоном. Материал
берут с обязательным надавливанием
шпателем на корень языка для наиболее
полного открытия глоточного отверстия.
Тампон вводят ватным концом кверху за
мягкое небо в носоглотку и проводят 2-3 раза
по задней стенке. При извлечении из
носоглотки тампон не должен касаться
окружающих тканей (зубы, слизистая щек,
язык, небный язычек). После извлечения из
носоглотки содержащуюся на тампоне слизь
засевают на чашки (сывороточный агар и
сывороточный агар с линкомицином) или
помещают в транспортировочную среду для
немедленной доставки в лабораторию.
Допускается применение готовых
питательных транспортировочных сред,
разрешенных к применению в Российской
Федерации в установленном порядке.
6.
Доставка и хранение материала
Материал
для бактериологических и серологических
исследований доставляют в
бактериологическую лабораторию немедленно
после отбора в специальных контейнерах,
способных поддерживать температуру 37 град.
C. При невозможности быстрой доставки
материала из отделения в лабораторию
(ночное время, выходные и праздничные дни и
др.) материал хранят следующим образом:
-
посевы ликвора на первичной чашке с
"шоколадным" агаром и в 0,1% полужидком
питательном агаре, а так же посев крови на
гемокультуру хранят в условиях термостата
при 37 град. C;
- нативный ликвор и кровь
для серологических исследований хранят в
условиях холодильника при +4 град. C. В
лаборатории нативный ликвор используют
только для бактериоскопии и постановки
серологических реакций
(латекс-агглютинация, ВИЭФ и др.). Для
бактериологического посева хранившийся в
холодильнике нативный ликвор не
используют.
7. Методы исследования
7.1.
Бактериоскопия.
7.1.1. Мазок нативного
ликвора.
На предметное стекло наносят
каплю ликвора из осажденного после
центрифугирования слоя и высушивают при
комнатной температуре или в условиях
термостата при 37 град. C. Далее на препарат
наносят краситель (водно-спиртовой раствор
метиленовой сини) и после 2-х минутной
экспозиции проводят тщательное, но
осторожное промывание водопроводной водой.
Препарат подсушивают и микроскопируют под
иммерсией при большом увеличении,
просматривая не менее 20 полей зрения или до
обнаружения морфологически четких
микробных клеток.
7.1.2. Культуральный
мазок по Граму в модификации Калины.
На
обезжиренное стекло наносят каплю
стерильного физиологического раствора. В
нем суспензируют культуру и туда же петлей
вносят каплю спиртового раствора
бриллиантовой зелени. После подсыхания
препарат фиксируют над пламенем. Затем на
препарат наливают основной краситель.
Время экспозиции 1,5-2 минуты. После этого
краску сливают и стекло в наклонном
положении промывают водой. Далее препарат в
наклонном положении отмывают спиртом до
отхождения облачков краски и немедленно
промывают водой. Затем производят
докрашивание препарата водным раствором
фуксина в течение 2-х минут, после этого
окончательно промывают водой и
просушивают. Культуральный мазок
просматривают под иммерсией при большом
увеличении: грамотрицательные бактерии
выглядят яркорозовыми, грамположительные -
сине-черными.
7.1.3. Мазок препарата
"толстая капля" крови.
На середину
предметного стекла наносят каплю крови и
распределяют с помощью чистого стерильного
аппликатора так, чтобы диаметр мазка
соответствовал величине пятикопеечной
монеты. Стекло оставляют в горизонтальном
положении до подсыхания крови. Данный
фрагмент исследования выполняют
непосредственно у постели больного при его
поступлении в стационар. Далее препарат
доставляют в бактериологическую
лабораторию. Окраску мазка производят
водно-спиртовым раствором метиленовой сини
в течение 2-3 минут, без предварительной
фиксации. После окрашивания препарат
осторожно промывают водой и подсушивают на
воздухе. Препарат смотрят под иммерсией при
большом увеличении, просматривая не менее 20
полей зрения или до обнаружения
морфологически четких микробных клеток.
7.2. Бактериологический посев.
При
отборе и посеве исследуемого материала
следует соблюдать следующие требования:
исключить случайную контаминацию
материала посторонней микрофлорой и не
допустить гибели возбудителя с момента
взятия материала для анализа и до начала
работы с ним в лаборатории. Первое условие
обеспечивают правильным забором материала,
точным доступом к очагу инфекции,
соблюдением асептики; второе - доставкой
образцов или посевов в лабораторию
незамедлительно в теплом виде или
временное сохранение до доставки в
условиях термостата при 37 град. C в течение
не более чем 12 часов.
7.2.1.
Бактериологический посев спинномозговой
жидкости.
Первичный бактериологический
посев СМЖ на чашку с "шоколадным" агаром
выполняют непосредственно "у постели
больного" в стационаре после проведения
пункции. Чашки с питательной средой, так же
как и все необходимые для забора
патологического материала принадлежности
(пустые стерильные пробирки, пробирки с 0,1%
полужидким сывороточным агаром, стерильные
предметные стекла для приготовления
препарата "толстая капля" крови, флаконы с
питательными средами для посева крови) в
достаточном количестве хранят в профильном
отделении стационара или их немедленно (при
необходимости) доставляют из
бактериологической
