"государственная фармакопея ссср. xi издание"(выпуск 2. "общие методы анализа. лекарственное растительное сырье")
методы, в некоторых случаях пользуются
определением белка по содержанию общего
азота в препарате.
1. Колориметрические
методы определения белка
При определении
белка в лекарственных препаратах при
помощи колориметрических методов
предварительно строят калибровочный
график с использованием стандартного
образца белка, указанного в частных статьях
(бычьего сывороточного альбумина,
сывороточного альбумина человека или
аминокислоты тирозина).
При определении
белка в испытуемых пробах соблюдают те же
условия проведения реакций и измерения
поглощения растворов, что и при построении
калибровочного графика.
1. Определение
белка с биуретовым реактивом
Метод
основан на образовании в щелочной среде
окрашенного в фиолетовый цвет комплекса
ионов двухвалентной меди с пептидными
связями молекулы белка.
Биуретовую
реакцию нельзя проводить в присутствии
солей аммония из-за образования медно -
аммиачных комплексов.
1 мл раствора
препарата, содержащего 1-10 мг испытуемого
белка, помещают в пробирку, прибавляют 4 мл
биуретового реактива, перемешивают и
оставляют на 30 мин при комнатной
температуре. Оптическую плотность раствора
измеряют на спектрофотометре при длине
волны в диапазоне от 540 до 650 нм в кювете с
толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора
сравнения используют смесь этих же
реактивов без препарата.
Калибровочный
график строят в пределах концентраций от 1
до 10 мг стандартного образца белка, измеряя
оптическую плотность растворов при
выбранной длине волны.
2.
Микроопределение белка с реактивом
Бенедикта
Принцип метода тот же, что и при
определении белка с биуретовым
реактивом.
2 мл раствора препарата,
содержащего 0,1-2 мг испытуемого белка,
помещают в пробирку, прибавляют 2 мл 6%
раствора натра едкого, 0,2 мл реактива
Бенедикта, перемешивают и оставляют на 15
мин при комнатной температуре. Оптическую
плотность измеряют на спектрофотометре при
длине волны 330 нм в кювете с толщиной слоя 10
мм. В качестве раствора сравнения
используют смесь этих же реактивов без
препарата.
Калибровочный график строят
в пределах концентраций от 0,1 до 2 мг
стандартного образца белка, измеряя
оптическую плотность раствора при 330 нм.
3.
Определение белка по методу Лоури
Метод
основан на образовании окрашенных
продуктов ароматических аминокислот и
цистеина с реактивом Фолина в сочетании с
биуретовой реакцией на пептидные связи.
1 мл раствора препарата, содержащего 0,025-0,250
мг испытуемого белка, помещают в пробирку,
прибавляют 2 мл реактива 1 и оставляют при
комнатной температуре на 10 мин. Затем
прибавляют 0,5 мл реактива Фолина,
перемешивают и через 30-40 мин измеряют
оптическую плотность на спектрофотометре
при длине волны 750 нм в кювете с толщиной
слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения
используют смесь этих же реактивов без
препарата.
Калибровочный график строят
в пределах концентраций от 0,025 до 0,250 мг
стандартного образца белка, измеряя
оптическую плотность растворов при 750
нм.
4. Определение белка по методу Лоури
в модификации Сяткина
Метод Лоури в
модификации Сяткина используют для
определения содержания белка в препаратах
с повышенным содержанием липо- и
гликопротеидов.
0,1 мл раствора
препарата, содержащего 0,5-2,5 мг испытуемого
белка, помещают в пробирку, прибавляют 0,8 мл
раствора натра едкого (1 моль/л) и 0,1 мл 1%
раствора натрия дезоксихолата, затем
прибавляют 4 мл реактива II, смесь
перемешивают. После просветления раствора
прибавляют 0,5 мл реактива Фолина,
немедленно перемешивают и оставляют на 30
мин в темном месте при комнатной
температуре. Оптическую плотность измеряют
на спектрофотометре при длине волны 750 нм в
кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве
раствора сравнения используют смесь этих
же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах
концентраций от 0,5 до 2,5 мг стандартного
образца белка, измеряя оптическую
плотность растворов при 750 нм.
5.
Определение белка по методу
Бредфорд
Метод основан на образовании
окрашенного в синий цвет комплекса
красителя кумасси ярко - голубого G-250 с
белком.
0,1 мл раствора препарата,
содержащего 0,01-0,10 мг испытуемого белка,
помещают в пробирку, прибавляют 5 мл
реактива Бредфорд, перемешивают и
оставляют при комнатной температуре в
течение одинакового времени в интервале от
2 до 60 мин. Оптическую плотность измеряют на
спектрофотометре при длине волны 595 нм в
кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве
раствора сравнения используют смесь этих
же реактивов без препарата.
Калибровочный график строят в пределах
концентраций от 0,01 до 0,10 мг стандартного
образца белка, измеряя оптическую
плотность растворов при 595 нм.
6.
Определение белка по методу
Седмака
Принцип метода тот же, что и в
методе Бредфорд. Метод применим для
определения суммарного количества белков и
полипептидов с молекулярной массой более
3000 дальтон.
1,5 мл раствора препарата,
содержащего 0,010-0,150 мг испытуемого белка,
помещают в пробирку, прибавляют 1,5 мл
раствора кумасси ярко - голубого G-250,
перемешивают и выдерживают при комнатной
температуре в течение одинакового времени
в интервале от 5 мин до 3 ч. Оптическую
плотность измеряют на спектрофотометре при
двух длинах волн: 620 и 465 нм в кювете с
толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора
сравнения используют смесь этих же
реактивов без препарата и кумасси ярко -
голубого G-250.
Калибровочный гр
