"государственная фармакопея ссср. xi издание"(выпуск 2. "общие методы анализа. лекарственное растительное сырье")
Для химической стерилизации растворами
используют перекись водорода и
надкислоты.
Эффективность стерилизации
растворами зависит от концентрации активно
действующего вещества, времени
стерилизационной выдержки и температуры
стерилизующего раствора.
При
стерилизации 6% раствором перекиси водорода
температура стерилизующего раствора
должна быть не менее 18 град.С, время
стерилизационной выдержки - 6 ч; при
температуре 50 град. С - 3 ч.
При
стерилизации 1% раствором дезоксона-1 (по
надуксусной кислоте) температура
стерилизующего раствора должна быть не
менее 18 град.С, время стерилизационной
выдержки-45 мин.
Допускается
использование других стерилизующих
средств, обеспечивающих стерильность и
сохранность объекта. Режим должен быть
обоснован и указан в нормативно -
технической документации.
Химическую
стерилизацию растворами проводят в
закрытых емкостях из стекла, пластмассы или
емкостях, покрытых неповрежденной эмалью,
при полном погружении изделия в раствор на
время стерилизационной выдержки. После
этого изделие должно быть промыто
стерильной водой в асептических
условиях.
Метод рекомендуется для
изделий из полимерных материалов, резины,
стекла, коррозионно - стойких металлов.
Контроль параметров стерилизации
растворами химических препаратов проводят
химическим и физическим методами,
определяя содержание активного
действующего вещества в исходном и рабочем
растворах, а также температуру рабочего
раствора.
Стерилизация
фильтрованием
Растворы термолабильных
веществ стерилизуют фильтрованием с
помощью мембранных и глубинных фильтров,
задерживающих микроорганизмы и их споры.
Мембранные фильтры характеризуются
ситовым механизмом задержания и постоянным
размером пор при эксплуатации.
Максимальный диаметр пор стерилизующего
мембранного фильтра не превышает 0,3 мкм.
Глубинные фильтры характеризуются сложным
механизмом задержания (ситовым,
адсорбционным, инерционным) и в большинстве
случаев непостоянным размером пор. Для
мембранных фильтров указывается в паспорте
"точка пузырька" (минимальное давление газа,
необходимое для вытеснения жидкости из
фильтра) - величина, непосредственно
связанная с максимальным диаметром пор в
фильтре.
При стерилизации
фильтрованием перед стерилизующим
фильтром помещают один или несколько
префильтров. Поры префильтрата больше пор
фильтра или равны им.
Глубинные фильтры
и префильтры, содержащие асбестовые и
стеклянные волокна, как правило, не должны
применяться для стерилизации
лекарственных средств, вводимых
парентерально. В случае их использования
после них должен быть установлен
стерилизующий мембранный фильтр.
Перед
началом фильтрования и после него
проверяют герметичность собранной
установки и целостность мембранного
фильтра, например, путем определения "точки
пузырька".
Глубинные фильтры с помощью
этого теста не проверяют. Фильтрование
проводят, применяя положительное давление
(до 0,7 МПа для мембранных фильтров) с
нестерильной стороны установки. При
использовании глубинных фильтров
необходимо строго соблюдать указанные в
паспорте температуру, рН, давление. Следует
избегать гидравлических ударов.
Продолжительность фильтрования не должна
превышать 8 ч.
Стерилизацию
фильтрованием и розлив раствора проводят в
асептических условиях. Эффективность
стерилизации фильтрованием проверяют
прямым посевом пробы фильтрата в
питательную среду.
Радиационный метод
стерилизации
Облучение объектов в
конечной упаковке производят на гамма -
установках, ускорителях электронов и
других источниках ионизирующего излучения
дозой 25 кГр (2,5 Мрад) или другими дозами в
зависимости от конкретных условий
(микробная обсемененность продукции до
стерилизации, радиорезистентность
контаминантов, величина коэффициента
надежности стерилизации). Стерилизацию
проводят в соответствии со "Сводом правил,
регламентирующих проведение в странах -
членах СЭВ радиационной стерилизации
материалов и изделий медицинского
назначения" и "Сводом правил,
регламентирующих проведение в странах -
членах СЭВ радиационной стерилизации
лекарственных средств" и утвержденными
инструкциями на каждый вид изделия.
Радиационный метод стерилизации может быть
рекомендован для изделий из пластмасс,
изделий одноразового использования в
упаковке, перевязочных материалов,
некоторых лекарственных средств и других
видов медицинской продукции.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ЗОЛЫ
Около 1 г препарата или 3-5 г
измельченного лекарственного
растительного сырья (точная навеска)
помещают в предварительно прокаленный и
точно взвешенный фарфоровый, кварцевый или
платиновый тигель, равномерно распределяя
вещество по дну тигля. Затем тигель
осторожно нагревают, давая сначала
веществу сгореть или улетучиться при
возможно более низкой температуре.
Сжигание оставшихся частиц угля надо тоже
вести при возможно более низкой
температуре; после того как уголь сгорит
почти полностью, увеличивают пламя.
При
неполном сгорании частиц угля остаток
охлаждают, смачивают водой или насыщенным
раствором аммония нитрата, выпаривают на
водяной бане и остаток прокаливают. В
случае необходимости такую операцию
повторяют несколько раз.
Прокаливание
ведут при слабом красном калении (около 500
град. С) до постоянной массы, избегая
сплавления золы и спекания ее со стенками
тигля. По окончании прокаливания тигель
охлаждают в эксикаторе и
взвешивают.
Определение золы,
нерастворимой в хлористоводородной
кислоте
К остатку в тигле, полученному
после сжигания препарата или
лекарственного растительного сырья,
прибавляют 15 мл 10% раствора
хлористоводородной кислоты, тигель
накрывают часовым стеклом и нагревают 10 мин
на кипящей водяной бане. К содержимому
тигля прибавляют 5 мл горячей воды, обмывая
ею часовое стекло. Жидкость фильтруют через
беззольный фильтр, перенося на него остаток
с помощью горячей воды. Фильтр с остатком
промывают горячей водой до отрицательной
реакции на хлориды в промывной воде,
переносят его в тот же тигель, высушивают,
сжигают, прокаливают, как указано выше, и
взвешивают.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАТНОЙ
ЗОЛЫ
Точную навеску препарата (около 1 г,
если в соответствующей частной статье нет
других указаний) помещают в предварительно
прокаленный и точно взвешенный фарфоровый,
кварцевый или платиновый тигель, смачивают
1 мл концентрированной серной кислоты и
осторожно нагревают на сетке или песчаной
бане до удаления паров серной кислоты.
Затем прокаливают при слабом калении (около
500 град. С) до постоянной массы, избегая
сплавления золы и спекания ее со стенками
тигля. По окончании прокаливания тигель
охлаждают в эксикаторе и взвешивают.
В
случае трудного сгорания прибавление
концентрированной серной кислоты и
прокаливание повторяют.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ
ПРЕПАРАТОВ
Фермент - это белок,
обладающий каталитическими свойствами.
Принцип, положенный в основу всех методов
определения активности фермента (Е),
заключается в регистрации скорости
исчезновения субстрата (S) (т.е. вещества, на
которое действует фермент) или скорости
образования продуков реакции
([Р]).
Требования к условиям проведения
ферментативной реакции
Ферментативная
реакция должна проводиться в строго
определенных условиях с учетом следующих
факторов.
1. Начальная скорость реакции
(V0). Типичная кинетическая кривая
ферментативной реакции приведена на рис. 1.
<*> Для каждой ферментативной реакции
могут быть подобраны условия, при которых
начальный участок кривой линеен, т.е.
зависимость концентрации образовавшегося
продукта или израсходованного субстрата от
времени наблюдения (t) имеет прямо
пропорциональный характер.
--------------------------------
<*> Рис. 1. Типичная
кинетическая кривая.
На оси абсцисс -
время наблюдения, на оси ординат -
концентрация образовавшегося продукта.
(Рисунок не приводится).
Под начальной
скоростью реакции в этих условиях понимают
скорость, соответствующую линейному
участку, и определяют ее как тангенс угла
наклона этого участка.
Поскольку
длительность прямолинейного участка
кинетической кривой от опыта к опыту
несколько изменяется, время инкубации
должно составлять не более 70% и не менее 20%
времени соответствующего прямолинейного
участка.
2. Концентрация субстрата ([S]).
Скорость реакции зависит от концентрации
субстрата вплоть до его насыщающей
концентрации. Под насыщающей концентрацией
понимают такую концентрацию субстрата, при
которой скорость реакции перестает
повышаться при дальнейшем увеличении
концентрации субстрата (Рис. 2, а). <*> При
проведении ферментативной реакции
реакционная смесь должна содержать такое
количество субстрата, которое обеспечит
насыщение фермента в течение всего хода
определения (количество субстрата, взятого
для проведения ферментативной реакции,
должно быть примерно на 30% выше значения
точки насыщения).
После выбора
насыщающей концентрации субстрата
необходимо проверить, сохраняется ли при
ней линейная зависимость [Р] от t.
В
случае фермента, для которого характерно
ингибирование субстратом (Рис. 2, б), <*>
оптимальной концентрацией субстрата
является та концентрация, при которой
скорость реакции максимальна (точка
перегиба на экспериментальной кривой
зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата).
--------------------------------
<*> Рис. 2.
Зависимость скорости реакции v от
концентрации субстрата (S).
а -
концентрация субстрата; б - фермент, для
которого характерно ингибирование
субстратом. (Рисунок не приводится).
3.
Концентрация фермента ([Е]). Выбор
необходимой концентрации фермента
осуществляется экспериментально при
помощи построения кривой зависимости
скорости реакции от концентрации фермента.
Используется участок прямолинейности так,
чтобы выбранная точка отстояла не менее чем
на 30% как от нижней, так и от верхней
концентрации фермента, ограничивающих
прямолинейный участок кривой (рис. 3).
<*>
--------------------------------
<*> Рис. 3.
Зависимость скорости реакции v от
концентрации фермента (Е).
Используется
участок прямолинейности так, чтобы
выбранная точка отстояла не менее чем на 30%
как от нижней (а), так и от верхней (б)
концентрации фермента, ограничивающих
прямолинейный участок кривой. (Рисунок не
приводится).
После выбора концентрации
фермента необходимо проверить, сохраняется
ли при ней линейная зависимость [Р] от t при
выбранном значении насыщающей
концентрации субстрата.
4. Температура.
Ферментативную реакцию рекомендуется
проводить в термостате при температуре (37
+/-0,1) град. С. Предварительно каждый из
реагентов необходимо прогреванием довести
до 37 град. С.
5. рН. Типичная кривая,
описывающая зависимость скорости
ферментативной реакции от рН, для
большинства ферментов приведена на рис. 4
<*>. Активность следует определять при
оптимальном значении рН. Оптимальное
значение рН должно быть определено при
выбранных значениях концентрации фермента
и насыщающей концентрации субстрата,
температуре (37 +/-0,1) град. С и использовании
буферного раствора того состава, который не
ингибирует фермент.
--------------------------------
<*> Рис. 4.
Зависимость скорости реакции v от значения
рН. (Рисунок не приводится).
После выбора
оптимального значения рН необходимо
проверить, сохраняется ли при этом рН
линейная зависимость [Р] от t при выбранных
значениях концентрации фермента и
насыщающей концентрации субстрата.
6.
Кофакторы. Существуют ферменты, для
проявления каталитических свойств которых
необходимо присутствие кофакторов,
например, коферментов - производных
витаминов, ионов металлов и др.
Для
определения оптимальной концентрации
кофактора следует построить кривую
зависимости скорости реакции от
концентрации кофактора, аналогичную
зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата, и по этой кривой
выбрать насыщающую концентрацию
кофактора.
После выбора насыщающей
концентрации кофактора необходимо
проверить, сохраняется ли при ней линейная
зависимость [Р] от t.
Конкретные
параметры ферментативной реакции
указываются в частных статьях.
МЕТОДЫ
КОЛИЧЕСТВЕННОЙ РЕГИСТРАЦИИ
СКОРОСТИ
ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
Скорость
ферментативной реакции количественно
можно измерить по убыли субстрата или по
образованию продукта реакции.
Предпочтительнее регистрировать скорость
образования продукта, поскольку это
обеспечивает большую точность
определения.
Для количественной
регистрации скорости ферментативной
реакции используют методы, связанные с
отбором проб из реакционной смеси, и
регистрирующие методы, основанные чаще
всего на спектральных свойствах субстрата
или продукта реакции.
Определение
белка
Определение содержания белка в
препарате проводят одним из методов,
приведенных в общей статье "Определение
белка".
ЕДИНИЦЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ
АКТИВНОСТИ
Активность ферментов
выражается в Международных единицах (ME) или
единицах действия (ЕД).
ME - это такое
количество фермента, которое при заданных
условиях катализирует превращение одного
микромоля субстрата за 1 мин (или одного
микроэквивалента затронутых реакцией
групп в тех случаях, когда атакуется более
одной группы в каждой молекуле
субстрата).
ЕД - это условная единица,
величина которой указывается в частных
статьях.
Нормируются:
Удельная
активность препарата - выражается в
единицах ферментативной активности
фермента (ME или ЕД) на 1 мг препарата и на 1 мг
белка (вторая величина характеризует
чистоту препарата).
Доза выражается в
единицах ферментативной активности (ME или
ЕД) на единицу лекарственной
формы.
Определение активности ферментных
препаратов
в сравнении со стандартным
образцом
С целью снижения погрешности
методов определения ферментативной
активности необходимо проводить
определение ферментативной активности
препарата в сравнении со стандартным
образцом. Стандартным образцом является
высокоочищенный ферментный препарат,
качество которого отвечает требованиям
соответствующей нормативно - технической
документации.
Определение
ферментативной активности испытуемого
препарата и стандартного образца проводят
в одинаковых условиях опыта.
Активность
препарата (А) в соответствующих единицах (ME
или ЕД) вычисляют по формуле:
Ас х Пс х К
А = ---------------
Пр
где Ac -
ферментативная активность стандартного
образца в единицах (ME или ЕД) на миллиграмм
белка или препарата; Пс - величина
измеряемого параметра для стандартного
образца; Пр - величина измеряемого
параметра для испытуемого препарата; К -
коэффициент, выравнивающий концентрации
растворов испытуемого препарата и
стандартного образца.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА
В ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТАХ
Белки -
высокомолекулярные природные органические
вещества, построенные из L-аминокислот.
Для количественного определения белка
используют колориметрические и
спектрофотометрические
