"методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов. методические указания. мук 4.2.577-96"(утв. госкомсанэпиднадзором рф 29.10.1996)

в пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в течение (30 +/- 1) мин.
6.1.8. Реактивы для окраски по Граму
(модификация Г.П.Калины)
Реактив 1.
К 100,0 куб. см этилового спирта добавляют 0,5 г кристаллического фиолетового.
Реактив 2.
К 96,0 куб. см 0,5-процентного спиртового раствора йодистого калия добавляют 2,0 куб. см 5-процентного спиртового раствора основного фуксина и 2,0 куб. см 5-процентного спиртового раствора йода.
Примечание. Растворение йодистого калия в спирте рекомендуется проводить в водяной бане при температуре от 45 до 50 град. С при постоянном помешивании.
6.1.9. Приготовление реактивов из метиленового голубого
Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого.
10 г метиленового голубого смешивают со 100,0 куб. см 96-процентного этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) град. С на (24 +/- 1) ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре. Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37 +/- 1) град. С не более 3 месяцев при условии герметичной укупорки.
Приготовление рабочего раствора метиленового голубого.
Основной раствор помещают в водяную баню при температуре (45 +/- 1) град. С на (8 +/- 2) мин., перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры (20 +/- 1) град. С и 5,0 куб. см этого раствора прибавляют к 195,0 куб. см дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения рабочего раствора метиленового голубого - не более 7 суток при температуре от 8 до 10 град. С.
Приготовление раствора метиленового голубого для окраски препаратов.
К 30,0 куб. см основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100,0 куб. см дистиллированной воды и 1,0 куб. см раствора гидроокиси калия с массовой концентрацией 10 г/куб. дм.
6.1.10. Приготовление карболового раствора
кристаллического фиолетового для окраски препаратов
1 г красителя кристаллического фиолетового растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до кашицы, прибавляют небольшими порциями 10,0 куб. см 96-процентного этилового спирта. Доводят объем до 100 куб. см дистиллированной водой. Таким образом получают основной раствор для приготовления рабочего раствора.
К 10,0 куб. см основного карболового раствора кристаллического фиолетового добавляют 90,0 куб. см дистиллированной воды. Тщательно перемешивают.
Растворы хранят в темном флаконе под притертой пробкой.
6.1.11. Мясо - пептонный бульон
Говяжье мясо, освобожденное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и оставляют на (18 +/- 6) ч при температуре (5 +/- 1) град. С. Для ускорения процесса выделения питательных веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают при температуре (50 +/- 5) град. С в течение (1 +/- 0,1) ч и затем кипятят (35 +/- 5) мин. После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой водой до первоначального объема, добавляют к нему (1,0 +/- 0,1)-процентного пептона и (0,5 +/- 0,1)-процентного хлористого натрия. Устанавливают с помощью 1H раствора гидроокиси натрия активную кислотность (7,3 +/- 0,1) ед. pH. Приготовленный бульон разливают в колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в течение (20 +/- 1) мин.
6.1.12. Мясо - пептонный агар
К 1,0 куб. дм мясо - пептонного бульона или перевара Хоттингера, с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/л добавляют 15 г мелко нарезанного агара в волокнах или порошке. После 10 - 15 - минутного набухания агар - агара смесь кипятят при постоянном помешивании до полного его растворения. Полученную среду после установления активной кислотности (7,3 +/- 0,1) ед. pH фильтруют в горячем виде через ватно - марлевый фильтр, разливают во флаконы и пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в течение 20 мин.
6.2. Специальные питательные среды и реактивы
6.2.1. Среды для определения общего
количества мезофильных аэробных и факультативно -
анаэробных микроорганизмов
6.2.1.1. Среда для определения аэробных и факультативно - анаэробных микроорганизмов.
Сухой питательный агар промышленного
производства (на основе килечного
гидролизата) - 35 г
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 2,5 г
Глюкоза - 1,0 г
Вода дистиллированная - до 1000,0 куб. см
pH - 7,0
Стерилизация в автоклаве при (121 +/- 1) град. С в течение (20 +/- 1) мин.
6.2.1.2. Сухие питательные среды промышленного производства по ТУ 49513-83 или по ТУ 10-02-02-789-177-94.
Подготовку сред для посевов проводят согласно прописи на этикетке.
6.2.2. Среды и реактивы для обнаружения бактерий группы
кишечных палочек и эшерихий коли
6.2.2.1. Среда Кесслер (с лактозой)
К 1,0 куб. дм водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50,0 куб. см стерильной желчи крупного рогатого скота. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании 20 - 30 мин. Затем фильтруют ее через ватно - марлевый фильтр, добавляют 2,5 г лактозы; доводят объем водой до 1 куб. дм. Устанавливают активную кислотность (7,5 +/- 0,1) ед. pH, используя 1H растворы NaOH или HCl и проверяя значение pH на потенциометре. Добавляют 4,0 куб. см 1-процентного йодного раствора кристаллического фиолетового, разливают в пробирки по 10,0 куб. см или колбочки по 40,0 - 50,0 куб. см, закладывают поплавки. Стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С.
6.2.2.2. Сухая среда Кесслера промышленного производства по ТУ 10.02.875-90
Подготовку среды для посева проводят согласно прописи на этикетке.
6.2.2.3. Среды сухие Левина, Эндо
Среды Левина (эозинметиленовоголубой агар), Эндо промышленного выпуска готовят согласно прописи, указанной на этикетке банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре (4 +/- 2) град. С до 10 суток.
6.2.2.4. Среда на индол
10,0 г сухого панкреатического гидролизата казеина (или 100,0 куб. см жидкого панкреатического гидролизата казеина с содержанием 500 куб. мг аминного азота), 5 г хлористого натрия, 1 г DL-триптофана растворяют в 1,0 куб. дм дистиллированной воды. Доводят активную кислотность (7,0 +/- 0,1) ед. pH 1H растворами NaOH или HCl и, измеряя значение pH на потенциометре, разливают в пробирки по 5,0 куб. см, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С.
6.2.2.5. Среда Кларка
Взвешивают 5 г пептона, 5 г глюкозы, 5 г двузамещенного фосфорно - кислого калия. Растворяют ингредиенты в 950,0 куб. см дистиллированной воды, устанавливают активную кислотность (6,9 +/- 0,1) ед. pH, используя 1H растворы NaOH или HCl. Проверяют pH на потенциометре. Доводят общий объем до 1000,0 куб. см дистиллированной водой и при необходимости фильтруют. Разливают в пробирки по 5,0 куб. см, стерилизуют в течение (20 +/- 1) мин. при (115 +/- 1) град. С.
6.2.2.6. 90-процентный раствор этилового спирта
В колбу, емкостью 1000 куб. см, с 900,0 куб. см 96-процентного этилового спирта добавляют 60,0 куб. см дистиллированной воды.
6.2.2.7. Раствор индикатора метилового красного
0,1 г индикатора метилового красного помещают в мерную колбу, вместимостью 500 куб. см, растворяют в 300,0 куб. см 90-процентного раствора этилового спирта, доливают до 500,0 куб. см дистиллированной водой. Хранят раствор в колбе с притертой пробкой при температуре (4 +/- 2) град. С.
6.2.2.8. 0,5-процентный раствор бромтимолового синего в спирте
Взвешивают 0,5 г бромтимолового синего, помещают в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят этиловым спиртом до метки. Раствор хранят при температуре (4 +/- 2) град. С течение 30 - 35 суток в колбе с притертой пробкой.
6.2.2.9. 0,5-процентный и 0,1-процентный растворы бриллиантового зеленого
Для приготовления 0,5-процентного раствора асептически взвешивают 0,5 г индикатора бриллиантового зеленого, вносят в стерильную мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят стерильной дистиллированной водой до метки.
Для приготовления 0,1-процентного раствора в стерильный мерный цилиндр или колбу к 10,0 куб. см исходного 0,5-процентного раствора индикатора добавляют 40,0 куб. см стерильной дистиллированной воды.
Растворы хранят в холодильнике в течение 7 - 10 суток.
6.2.2.10. 1,6-процентного раствор бромкрезолового пурпурного в спирте
Взвешивают 1,6 г индикатора бромкрезолового пурпурного и количественно переносят в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см. Доводят 96-процентным этиловым спиртом до метки. При необходимости фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в колбе со шлифом в условиях холодильника.
6.2.2.11. 5-процентный раствор alfa-нафтола
Взвешивают 5 г alfa-нафтола, растворяют в 100,0 куб. см 96-процентного этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед применением.
6.2.2.12. 40-процентный раствор гидроокиси калия
В стакане, вместимостью 100 куб. см взвешивают 40 г гидроокиси калия, переносят в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, растворяют в 60,0 куб. см дистиллированной воды, затем доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 - 6 град. С.
6.2.2.13. 1-процентный водный раствор генцианового (кристаллического) фиолетового
Взвешивают 1 г генцианового (кристаллического) фиолетового, помещают в мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 - 6 град. С в течение 7 суток.
6.2.2.14. Реактив на индол (Эрлиха)
Взвешивают 5 г пара - диметиламинобензальдегида в стеклянном стакане, вместимостью 100 куб. см, помещают в коническую колбу, вместимостью 200 куб. см, и растворяют в 50,0 куб. см этилового спирта. С помощью мерного цилиндра, вместимостью 100 куб. см, медленно добавляют 50,0 куб. см концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре 4 - 6 град. С.
6.2.2.15. Среда Козера
Взвешивают 1,5 г натрия - аммония фосфорно - кислого, 1 г калия фосфорно - кислого двузамещенного, 0,2 г магния сульфата, 3 г натрия лимонно - кислого трехзамещенного. Растворяют в 950,0 куб. см дистиллированной воды, добавляют 10,0 куб. см 0,5-процентного спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают активную кислотность (6,8 +/- 0,1) ед. pH растворами NaOH или HCl, проверяя значение pH на потенциометре. Доводят объем дистиллированной водой до 1,0 куб. дм. Разливают по 10,0 куб. см в пробирки, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С.
6.2.2.16. Среда Симмонса
Среду готовят аналогично среде Козера (п. 6.2.2.15.), но после измерения pH в нее добавляют 2 г агар - агара на 1000 куб. см, прогревают на водяной бане до расплавления агара, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.
6.2.2.17. Среда с 5% сахарозы
В 1000,0 куб. см дистиллированной воды растворяют 30 г сухого питательного агара (по ТУ 42-14-33-75 или по ТУ 10-02-789-177-94) и 50 г сахарозы. Стерилизуют в течение (30 +/- 1) мин. при (112 +/- 1) град. С.
6.2.3. Среды и реактивы для обнаружения
бактерий рода Salmonella
6.2.3.1. Магниевая среда
Среду готовят из трех растворов <*>.
1 раствор:
пептон - 4,2 г
натрий хлористый - 7,15 г
дрожжевой диализат или дрожжевой
экстракт (ЭКД) - 20 куб. см
или 2 г
калий фосфорно - кислый однозамещенный - 1,42 г
вода дистиллированная - 890,0 куб. см
--------------------------------
<*> - При необходимости использования среды двойной концентрации масса (объем) всех ингредиентов, кроме воды, удваивается.
2 раствор:
магний хлористый кристаллический
(MgCl2 x 6H2O) - 35,7 г
вода дистиллированная - 90,0 куб. см
3 раствор:
0,5-процентный водный раствор
бриллиантового зеленого - 0,9 куб. см
После растворения всех ингредиентов растворы соединяют, устанавливают активную кислотность (7,2 +/- 0,2) ед. pH, разливают приготовленную таким образом среду в колбы и флаконы. Среду стерилизуют при температуре (112 +/- 1) град. С в течение (30 +/- 1) мин.
6.2.3.2. Дрожжевой диализат
Взвешивают 1000 г свежих хлебных (прессованных) дрожжей, размешивают в 1000,0 куб. см дистиллированной воды в кастрюле до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей питьевой воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду, в которую предварительно наливают 1300,0 куб. см дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в жидкость. Диализ ведут при температуре 60 - 80 град. С в течение (6 +/- 0,5) ч. За это время количество жидкости в кастрюле должно уменьшиться примерно в 2 раза. Затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль и добавляют хлороформ (0,5% к общему объему жидкости) и сохраняют при 5 - 7 град. С до 7 месяцев.
6.2.3.3. Среда Мюллера
К 90,0 куб. см стерильного мясо - пептонного бульона добавляют:
- 4,5 г химически чистого мела (CaCO3), предварительно простерилизованного во флаконе сухим жаром (при 160 град. С в течение 2 ч);
- 10 куб. см раствора гипосульфита натрия (50 г чистого кристаллического гипосульфита натрия в мерной колбе доводят до 100,0 куб. см дистиллированной водой, стерилизуют текучим паром в течение (30 +/- 1) мин.);
- 2 куб. см раствора Люголя (металлического йода - 25 г, йодистого калия - 20 г, дистиллированной воды - 100,0 куб. см).
После добавления указанных ингредиентов смесь взбалтывают и разливают в необходимых количествах. Допускается использовать среду в течение 7 дней после приготовления.
6.2.3.4. Среда Кауфмана
К 100,0 куб. см среды Мюллера добавляют 0,2 куб. см 0,5-процентного водного раствора бриллиантового зеленого и 5,0 см 3 стерильной желчи крупного рогатого скота. Приготовленную смесь стерилизуют текучим паром и течение (30 +/- 1) мин. До стерилизации - среда зеленого цвета, после стерилизации она приобретает зеленовато - коричневый тон.
6.2.3.5. Приготовление селенитовой среды
6.2.3.5.1. Селенитовая среда накопления Лейфсона <*>
Натрий кислый селенисто - кислый - 4 г
Пептон импортный - 5

Медицинское законодательство »