"методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов. методические указания. мук 4.2.577-96"(утв. госкомсанэпиднадзором рф 29.10.1996)
в пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в
течение (30 +/- 1) мин.
6.1.8. Реактивы для
окраски по Граму
(модификация
Г.П.Калины)
Реактив 1.
К 100,0 куб. см
этилового спирта добавляют 0,5 г
кристаллического фиолетового.
Реактив
2.
К 96,0 куб. см 0,5-процентного спиртового
раствора йодистого калия добавляют 2,0 куб.
см 5-процентного спиртового раствора
основного фуксина и 2,0 куб. см 5-процентного
спиртового раствора йода.
Примечание.
Растворение йодистого калия в спирте
рекомендуется проводить в водяной бане при
температуре от 45 до 50 град. С при постоянном
помешивании.
6.1.9. Приготовление реактивов
из метиленового голубого
Приготовление
основного спиртового раствора
метиленового голубого.
10 г метиленового
голубого смешивают со 100,0 куб. см
96-процентного этилового спирта. Раствор
ставят в термостат при температуре (37 +/- 1)
град. С на (24 +/- 1) ч, а затем фильтруют в
термостате при той же температуре. Срок
хранения основного раствора метиленового
голубого в термостате при температуре (37 +/-
1) град. С не более 3 месяцев при условии
герметичной укупорки.
Приготовление
рабочего раствора метиленового
голубого.
Основной раствор помещают в
водяную баню при температуре (45 +/- 1) град. С
на (8 +/- 2) мин., перемешивают до полного
растворения кристаллов. Затем быстро
охлаждают до температуры (20 +/- 1) град. С и 5,0
куб. см этого раствора прибавляют к 195,0 куб.
см дистиллированной кипяченой воды. Смесь
хорошо перемешивают. Срок хранения
рабочего раствора метиленового голубого -
не более 7 суток при температуре от 8 до 10
град. С.
Приготовление раствора
метиленового голубого для окраски
препаратов.
К 30,0 куб. см основного
спиртового раствора метиленового голубого
прибавляют 100,0 куб. см дистиллированной
воды и 1,0 куб. см раствора гидроокиси калия с
массовой концентрацией 10 г/куб. дм.
6.1.10.
Приготовление карболового раствора
кристаллического фиолетового для окраски
препаратов
1 г красителя
кристаллического фиолетового растирают в
ступке с 2 г кристаллической карболовой
кислоты до кашицы, прибавляют небольшими
порциями 10,0 куб. см 96-процентного этилового
спирта. Доводят объем до 100 куб. см
дистиллированной водой. Таким образом
получают основной раствор для
приготовления рабочего раствора.
К 10,0
куб. см основного карболового раствора
кристаллического фиолетового добавляют 90,0
куб. см дистиллированной воды. Тщательно
перемешивают.
Растворы хранят в темном
флаконе под притертой пробкой.
6.1.11. Мясо -
пептонный бульон
Говяжье мясо,
освобожденное от жира и сухожилий,
пропускают через мясорубку, взвешивают,
складывают в кастрюлю, смешивают с двойным
количеством водопроводной воды и оставляют
на (18 +/- 6) ч при температуре (5 +/- 1) град. С. Для
ускорения процесса выделения питательных
веществ из мяса содержимое кастрюли
подогревают при температуре (50 +/- 5) град. С в
течение (1 +/- 0,1) ч и затем кипятят (35 +/- 5) мин.
После кипячения бульон в горячем состоянии
фильтруют через двойной бумажный фильтр.
Фильтрат доводят питьевой водой до
первоначального объема, добавляют к нему (1,0
+/- 0,1)-процентного пептона и (0,5 +/-
0,1)-процентного хлористого натрия.
Устанавливают с помощью 1H раствора
гидроокиси натрия активную кислотность (7,3
+/- 0,1) ед. pH. Приготовленный бульон разливают
в колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в
течение (20 +/- 1) мин.
6.1.12. Мясо - пептонный
агар
К 1,0 куб. дм мясо - пептонного бульона
или перевара Хоттингера, с концентрацией
аминного азота не менее 100 мг/л добавляют 15 г
мелко нарезанного агара в волокнах или
порошке. После 10 - 15 - минутного набухания
агар - агара смесь кипятят при постоянном
помешивании до полного его растворения.
Полученную среду после установления
активной кислотности (7,3 +/- 0,1) ед. pH
фильтруют в горячем виде через ватно -
марлевый фильтр, разливают во флаконы и
пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) град. С в
течение 20 мин.
6.2. Специальные питательные
среды и реактивы
6.2.1. Среды для
определения общего
количества
мезофильных аэробных и факультативно -
анаэробных микроорганизмов
6.2.1.1. Среда
для определения аэробных и факультативно -
анаэробных микроорганизмов.
Сухой
питательный агар промышленного
производства (на основе килечного
гидролизата) - 35 г
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 2,5
г
Глюкоза - 1,0 г
Вода дистиллированная - до 1000,0
куб. см
pH -
7,0
Стерилизация в автоклаве при (121 +/- 1)
град. С в течение (20 +/- 1) мин.
6.2.1.2. Сухие
питательные среды промышленного
производства по ТУ 49513-83 или по ТУ
10-02-02-789-177-94.
Подготовку сред для посевов
проводят согласно прописи на
этикетке.
6.2.2. Среды и реактивы для
обнаружения бактерий группы
кишечных
палочек и эшерихий коли
6.2.2.1. Среда
Кесслер (с лактозой)
К 1,0 куб. дм
водопроводной воды добавляют 10 г пептона и
50,0 куб. см стерильной желчи крупного
рогатого скота. Смесь кипятят на водяной
бане при помешивании 20 - 30 мин. Затем
фильтруют ее через ватно - марлевый фильтр,
добавляют 2,5 г лактозы; доводят объем водой
до 1 куб. дм. Устанавливают активную
кислотность (7,5 +/- 0,1) ед. pH, используя 1H
растворы NaOH или HCl и проверяя значение pH на
потенциометре. Добавляют 4,0 куб. см
1-процентного йодного раствора
кристаллического фиолетового, разливают в
пробирки по 10,0 куб. см или колбочки по 40,0 - 50,0
куб. см, закладывают поплавки. Стерилизуют в
течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С.
6.2.2.2. Сухая среда Кесслера промышленного
производства по ТУ 10.02.875-90
Подготовку
среды для посева проводят согласно прописи
на этикетке.
6.2.2.3. Среды сухие Левина,
Эндо
Среды Левина
(эозинметиленовоголубой агар), Эндо
промышленного выпуска готовят согласно
прописи, указанной на этикетке банок.
Изготовленные и разлитые в стерильные
чашки Петри среды можно хранить при
температуре (4 +/- 2) град. С до 10 суток.
6.2.2.4. Среда на индол
10,0 г сухого
панкреатического гидролизата казеина (или
100,0 куб. см жидкого панкреатического
гидролизата казеина с содержанием 500 куб. мг
аминного азота), 5 г хлористого натрия, 1 г
DL-триптофана растворяют в 1,0 куб. дм
дистиллированной воды. Доводят активную
кислотность (7,0 +/- 0,1) ед. pH 1H растворами NaOH
или HCl и, измеряя значение pH на
потенциометре, разливают в пробирки по 5,0
куб. см, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при
(121 +/- 1) град. С.
6.2.2.5. Среда Кларка
Взвешивают 5 г пептона, 5 г глюкозы, 5 г
двузамещенного фосфорно - кислого калия.
Растворяют ингредиенты в 950,0 куб. см
дистиллированной воды, устанавливают
активную кислотность (6,9 +/- 0,1) ед. pH,
используя 1H растворы NaOH или HCl. Проверяют pH
на потенциометре. Доводят общий объем до
1000,0 куб. см дистиллированной водой и при
необходимости фильтруют. Разливают в
пробирки по 5,0 куб. см, стерилизуют в течение
(20 +/- 1) мин. при (115 +/- 1) град. С.
6.2.2.6.
90-процентный раствор этилового спирта
В
колбу, емкостью 1000 куб. см, с 900,0 куб. см
96-процентного этилового спирта добавляют
60,0 куб. см дистиллированной воды.
6.2.2.7.
Раствор индикатора метилового красного
0,1 г индикатора метилового красного
помещают в мерную колбу, вместимостью 500
куб. см, растворяют в 300,0 куб. см
90-процентного раствора этилового спирта,
доливают до 500,0 куб. см дистиллированной
водой. Хранят раствор в колбе с притертой
пробкой при температуре (4 +/- 2) град. С.
6.2.2.8. 0,5-процентный раствор бромтимолового
синего в спирте
Взвешивают 0,5 г
бромтимолового синего, помещают в мерную
колбу, вместимостью 100 куб. см, и доводят
этиловым спиртом до метки. Раствор хранят
при температуре (4 +/- 2) град. С течение 30 - 35
суток в колбе с притертой пробкой.
6.2.2.9.
0,5-процентный и 0,1-процентный растворы
бриллиантового зеленого
Для
приготовления 0,5-процентного раствора
асептически взвешивают 0,5 г индикатора
бриллиантового зеленого, вносят в
стерильную мерную колбу, вместимостью 100
куб. см, и доводят стерильной
дистиллированной водой до метки.
Для
приготовления 0,1-процентного раствора в
стерильный мерный цилиндр или колбу к 10,0
куб. см исходного 0,5-процентного раствора
индикатора добавляют 40,0 куб. см стерильной
дистиллированной воды.
Растворы хранят
в холодильнике в течение 7 - 10 суток.
6.2.2.10. 1,6-процентного раствор
бромкрезолового пурпурного в спирте
Взвешивают 1,6 г индикатора бромкрезолового
пурпурного и количественно переносят в
мерную колбу, вместимостью 100 куб. см.
Доводят 96-процентным этиловым спиртом до
метки. При необходимости фильтруют через
бумажный фильтр. Хранят в колбе со шлифом в
условиях холодильника.
6.2.2.11.
5-процентный раствор alfa-нафтола
Взвешивают 5 г alfa-нафтола, растворяют в 100,0
куб. см 96-процентного этилового спирта.
Раствор готовят непосредственно перед
применением.
6.2.2.12. 40-процентный раствор
гидроокиси калия
В стакане,
вместимостью 100 куб. см взвешивают 40 г
гидроокиси калия, переносят в мерную колбу,
вместимостью 100 куб. см, растворяют в 60,0 куб.
см дистиллированной воды, затем доводят до
метки дистиллированной водой. Раствор
хранят при температуре 4 - 6 град. С.
6.2.2.13.
1-процентный водный раствор генцианового
(кристаллического) фиолетового
Взвешивают 1 г генцианового
(кристаллического) фиолетового, помещают в
мерную колбу, вместимостью 100 куб. см, и
доводят до метки дистиллированной водой.
Раствор хранят при температуре 4 - 6 град. С в
течение 7 суток.
6.2.2.14. Реактив на индол
(Эрлиха)
Взвешивают 5 г пара -
диметиламинобензальдегида в стеклянном
стакане, вместимостью 100 куб. см, помещают в
коническую колбу, вместимостью 200 куб. см, и
растворяют в 50,0 куб. см этилового спирта. С
помощью мерного цилиндра, вместимостью 100
куб. см, медленно добавляют 50,0 куб. см
концентрированной соляной кислоты. Раствор
хранят в колбе с притертой пробкой при
температуре 4 - 6 град. С.
6.2.2.15. Среда
Козера
Взвешивают 1,5 г натрия - аммония
фосфорно - кислого, 1 г калия фосфорно -
кислого двузамещенного, 0,2 г магния
сульфата, 3 г натрия лимонно - кислого
трехзамещенного. Растворяют в 950,0 куб. см
дистиллированной воды, добавляют 10,0 куб. см
0,5-процентного спиртового раствора
бромтимолового синего. Устанавливают
активную кислотность (6,8 +/- 0,1) ед. pH
растворами NaOH или HCl, проверяя значение pH на
потенциометре. Доводят объем
дистиллированной водой до 1,0 куб. дм.
Разливают по 10,0 куб. см в пробирки,
стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1)
град. С.
6.2.2.16. Среда Симмонса
Среду
готовят аналогично среде Козера (п. 6.2.2.15.),
но после измерения pH в нее добавляют 2 г агар
- агара на 1000 куб. см, прогревают на водяной
бане до расплавления агара, стерилизуют в
течение (15 +/- 1) мин. при (121 +/- 1) град. С.
Разливают в стерильные чашки Петри или
пробирки.
6.2.2.17. Среда с 5% сахарозы
В
1000,0 куб. см дистиллированной воды
растворяют 30 г сухого питательного агара
(по ТУ 42-14-33-75 или по ТУ 10-02-789-177-94) и 50 г
сахарозы. Стерилизуют в течение (30 +/- 1) мин.
при (112 +/- 1) град. С.
6.2.3. Среды и реактивы
для обнаружения
бактерий рода
Salmonella
6.2.3.1. Магниевая среда
Среду
готовят из трех растворов <*>.
1
раствор:
пептон - 4,2
г
натрий хлористый - 7,15
г
дрожжевой диализат или дрожжевой
экстракт (ЭКД) - 20 куб. см
или 2 г
калий фосфорно - кислый однозамещенный - 1,42
г
вода дистиллированная -
890,0 куб. см
--------------------------------
<*> -
При необходимости использования среды
двойной концентрации масса (объем) всех
ингредиентов, кроме воды, удваивается.
2
раствор:
магний хлористый
кристаллический
(MgCl2 x 6H2O)
- 35,7 г
вода дистиллированная
- 90,0 куб. см
3 раствор:
0,5-процентный водный раствор
бриллиантового зеленого - 0,9 куб.
см
После растворения всех ингредиентов
растворы соединяют, устанавливают активную
кислотность (7,2 +/- 0,2) ед. pH, разливают
приготовленную таким образом среду в колбы
и флаконы. Среду стерилизуют при
температуре (112 +/- 1) град. С в течение (30 +/- 1)
мин.
6.2.3.2. Дрожжевой диализат
Взвешивают 1000 г свежих хлебных
(прессованных) дрожжей, размешивают в 1000,0
куб. см дистиллированной воды в кастрюле до
состояния гомогенной массы, которую
переливают в целлофановый мешок,
предварительно промытый дистиллированной
водой. Мешок завязывают, обмывают под
струей питьевой воды, а затем
дистиллированной водой и погружают в
эмалированную посуду, в которую
предварительно наливают 1300,0 куб. см
дистиллированной воды. Мешок должен быть
полностью погружен в жидкость. Диализ ведут
при температуре 60 - 80 град. С в течение (6 +/- 0,5)
ч. За это время количество жидкости в
кастрюле должно уменьшиться примерно в 2
раза. Затем жидкость из кастрюли переливают
в стерильную бутыль и добавляют хлороформ
(0,5% к общему объему жидкости) и сохраняют
при 5 - 7 град. С до 7 месяцев.
6.2.3.3. Среда
Мюллера
К 90,0 куб. см стерильного мясо -
пептонного бульона добавляют:
- 4,5 г
химически чистого мела (CaCO3), предварительно
простерилизованного во флаконе сухим жаром
(при 160 град. С в течение 2 ч);
- 10 куб. см
раствора гипосульфита натрия (50 г чистого
кристаллического гипосульфита натрия в
мерной колбе доводят до 100,0 куб. см
дистиллированной водой, стерилизуют
текучим паром в течение (30 +/- 1) мин.);
- 2
куб. см раствора Люголя (металлического
йода - 25 г, йодистого калия - 20 г,
дистиллированной воды - 100,0 куб. см).
После добавления указанных ингредиентов
смесь взбалтывают и разливают в
необходимых количествах. Допускается
использовать среду в течение 7 дней после
приготовления.
6.2.3.4. Среда Кауфмана
К 100,0 куб. см среды Мюллера добавляют 0,2 куб.
см 0,5-процентного водного раствора
бриллиантового зеленого и 5,0 см 3 стерильной
желчи крупного рогатого скота.
Приготовленную смесь стерилизуют текучим
паром и течение (30 +/- 1) мин. До стерилизации -
среда зеленого цвета, после стерилизации
она приобретает зеленовато - коричневый
тон.
6.2.3.5. Приготовление селенитовой
среды
6.2.3.5.1. Селенитовая среда
накопления Лейфсона <*>
Натрий
кислый селенисто - кислый - 4 г
Пептон импортный - 5
