"контроль дезинфекционных камер. методические указания. мук 4.2.1035-01"(утв. главным государственным санитарным врачом рф 23.05.2001)

60 град. C при 60 мин. экспозиции, к 5-процентному раствору формалина при экспозиции 25 мин.;
- споры B.cereus, штамм 96, - к действию текучего пара в течение 4-6 мин. или кипячению в течение 25 мин.
5.3. Для поддержания устойчивости культуры следует хранить при температуре +4 град. C. Стафилококк и B.cereus - на мясопептонном агаре (МПА) в столбике под слоем стерильного вазелинового масла; культуру В-5 - на картофельно - глицериновой среде или 2-процентном глицериновом МПА. Можно хранить культуры в запаянных ампулах, лиофильно высушенные. Пересевать рабочие культуры стафилококка, B.cereus и В-5 следует не реже одного раза в 3 месяца.
6. Приготовление индикаторов биологических,
применяемых для определения устойчивости культур
и при контроле дезкамер
6.1. Испытание устойчивости культур к формалину и пару проводят на батистовых или бязевых тест - объектах. Для их приготовления кусок белого батиста или бязи погружают на 24 ч. в холодную водопроводную воду, затем стирают с мылом, кипятят, сушат и гладят горячим утюгом (с целью удаления аплитуры). В приготовленном куске ткани с помощью иглы выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм друг от друга, а в поперечном - на расстоянии 6 мм. По этим линиям ткань разрезают ножницами на тест - объекты и по 50 штук раскладывают в чашки Петри. Последние заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве 30 мин. при температуре 120 град. C (1 атм.).
6.2. Индикаторами биологического контроля эффективности дезинфекции вещей в камерах служат инсулиновые флаконы с сухими культурами бактерий (индикатор биологический БИК-ИЛЦ).
6.3. Культуры бактерий готовят следующим образом:
6.3.1. Суточную бульонную культуру стафилококка засевают на
скошенную поверхность питательного агара для выращивания
микроорганизмов и инкубируют в термостате при температуре (37 +/-
1) град. C в течение 18-24 ч. Выращенную культуру смывают с
помощью стерильных бус сахарозо - желатиновой средой и разводят
10
этой же средой до концентрации 2-10 м.к. в 1 мл. Затем
автоматической пипеткой по 0,02 мл взвеси культуры наносят
непосредственно на нижнюю внутреннюю поверхность инсулинового
флакона или пробирки Эппендорфа. Инсулиновые флаконы закрывают
ватно - марлевой пробкой. Флаконы и пробирки Эппендорфа помещают в
термостат при 37 град. C на сутки для подсушивания. Индикаторы
биологические БИК-ИЛЦ хранят в бытовом холодильнике. Срок годности
- 1 год.
6.3.2. Культуру микобактерий штамма В-5 выращивают на
картофельно - глицериновой среде или 2-процентном глицериновом
питательном агаре при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 4-х
суток. Затем добавляют сахарозо - желатиновую среду и с помощью
стерильных бус смывают выросшую культуру с поверхности агара. Этой
10
же средой доводят концентрацию культуры до 2-10 м.к. в 1 мл.
Автоматической пипеткой по 0,02 мл взвеси наносят на внутреннюю
поверхность инсулинового флакона и закрывают ватно - марлевой
пробкой. Ставят в термостат при 37 град. C на сутки для
подсушивания. Индикаторы биологические БИК-ИЛЦ хранят в
холодильнике. Срок годности - 6 месяцев.
6.3.3. Культуру B.cereus для получения спор высевают на
скошенный пшеничный агар и выращивают двое суток в термостате при
37 град. C, а затем еще 5-7 дней при комнатной температуре в
темном месте. Культуру проверяют перед смывом на спорообразование
(окрашенные по Граму мазки просматривают под микроскопом). К
дальнейшей работе пригодны культуры, содержащие не менее 80-90%
спор при просмотре 5 полей зрения. После этого выросшую культуру
смывают с поверхности с помощью сахарозо - желатиновой среды и
стерильных бус. В последующем доводят концентрацию спор до
10
2-10 м.к. в 1 мл. Автоматической пипеткой по 0,02 мл взвеси
наносят на внутреннюю поверхность инсулинового флакона или
пробирки Эппендорфа. Инсулиновые флаконы закрывают ватно -
марлевой пробкой. Флаконы и пробирки Эппендорфа помещают в
термостат при 37 град. C на сутки для подсушивания. Срок годности
- 1 год.
7. Определение устойчивости культур
к действию формалина
7.1. В день опыта готовят рабочие растворы формалина на стерильной дистиллированной воде. Концентрацию раствора берут в зависимости от вида культуры (устойчивость Staphylococcus aureus, штамм 906, испытывают в 2-процентном растворе, а устойчивость культуры Mycobacterium, штамм В5, - в 5-процентном растворе формалина). При постановке опытов в стеклянную колбу пипеткой наливают требуемый объем соответствующего раствора формалина (из расчета на каждый тест - объект по 3 мл). Легкими покачиваниями колбы достигают смачивания всех тест - объектов дезинфицирующим раствором и с этого момента начинают отсчет экспозиции. Через 10-20-30 мин. (для культур Staphylococcus aureus, штамм 906) и через 15-25-35 мин. (для тестов, зараженных культурой Mycobacterium, штамм В-5) стерильным пинцетом извлекают по 2 тест - объекта из раствора формалина и погружают для нейтрализации в пробирки с 10 мл 2-процентного раствора аммиака (1 мл 25-процентного нашатырного спирта + 9 мл стерильной дистиллированной воды). Через 5 минут тест - объекты переносят во вторую пробирку с 10 мл стерильного физраствора и также выдерживают 5 мин. Затем каждый тест - объект засевают в пробирки с 5 мл соответствующей жидкой питательной средой.
7.2. Контролем служат два тест - объекта, не подвергающиеся действию формалина, но погруженные в пробирку со стерильным физраствором на срок, равный действию формалина. Перед посевом контрольные тест - объекты промывают так же, как и опытные.
7.3. Посевы помещают в термостат при (37 +/- 1) град. C. Предварительные результаты учитывают через 24-48 ч. (для тестов с Mycobacterium штамм, В-5, - через 4 дня), окончательные - через 7 суток.
8. Определение термоустойчивости культур
8.1. Устойчивость культур к температуре проверяют в водяной бане (лучше с терморегулятором).
8.2. Суточные культуры Staphylococcus aureus, штамм 906, и 4-суточные Mycobacterium, штамм В-5, выращенные соответственно на МПА (pH = 7,2-7,4) и 2-процентном глицериновом агаре, смывают физиологическим раствором (5 мл на чашку Петри), фильтруют через ватно - марлевый фильтр и разводят до концентрации 2 млрд. микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту. Полученные суспензии разливают по 1 мл в три стерильные пробирки (по одной пробирке на каждую экспозицию), которые помещают в водяную баню, предварительно нагретую до 60 град. C. Для наблюдения за температурой в баню погружают опущенный в пробирку с водой термометр. Через 15-25-35 мин. из пробирок со взвесью культуры Staphylococcus aureus, штамм 906, и через 40-60-80 мин. из пробирок со взвесью культуры Mycobacterium, штамм В-5, стерильной пипеткой отбирают на каждую экспозицию 1 мл взвеси и засевают по 0,5 мл в две пробирки с 5 мл мясопептонного или 2-процентного глицеринового бульона.
8.3. Посевы выдерживают в термостате при (37 +/- 1) град. C в течение 7 суток. Предварительный учет результатов проводят через 24-48 ч. (для культуры Staphylococcus aureus, штамм 906) и через 72-96 ч. (для культуры Mycobacterium, штамм В-5).
8.4. Для проверки термоустойчивости культур B.cereus три пробирки со споровой взвесью помещают в кипящую водяную баню на 15-25-35 мин. По истечении этого времени по 0,5 мл взвеси из соответствующей пробирки засевают в две пробирки с мясопептонным бульоном (МПБ) и посевы инкубируют 7 суток при температуре (37 +/- 1) град. C. Контролем служит посев непрогретой взвеси испытуемой культуры в мясопептонный или 2-процентный глицериновый бульоны.
9. Определение устойчивости спор B.cereus к пару
9.1. Устойчивость спор B.cereus к пару проверяют в аппарате Ойль - Мюллера следующим образом:
В колбу наливают воду и нагревают ее до кипения. На предварительно обожженную сетку помещают два зараженных тест - объекта. Сетку вносят в зону действия текучего пара. Через 3 мин. действия пара тесты извлекают и засевают в две пробирки с бульоном. На обожженную сетку вновь вносят два теста на экспозицию 4 мин. и так повторяют, увеличивая экспозицию снова на 1 мин. до 9 мин. Засеянные тест - объекты помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) град. C на 7 дней. Предварительный учет результатов проводят через 48 ч.
9.2. Аппарат Ойль - Мюллера может быть заменен колбой емкостью 0,75-1 л с широким удлиненным горлом. Корковая пробка колбы на 1/3 срезается по вертикали для выхода пара. Через пробку должна быть пропущена проволока, имеющая на конце металлическую сетку диаметром 3-3,5 см, на которую помещают тест - объекты.
9.3. Если после воздействия формалина, соответствующей температуры и пара наблюдается рост культур в мясопептонном или 2-процентном глицериновом бульонах, необходимо произвести пересев на плотные питательные среды для того, чтобы убедиться в наличии роста исходной культуры.
9.4. Культуры, используемые для приготовления индикаторов биологических БИК-ИЛЦ, подвергаются контролю на термо- и формалиноустойчивость не реже 1 раза в 6 месяцев.
10. Проведение бактериологического контроля
10.1. Бактериологический контроль эффективности дезинфекции вещей в камерах проводится с помощью индикаторов биологических БИК-ИЛЦ, приготовленных по методике, указанной в п. 4.4.3., и упакованных в упаковочную ленту. Приготовленные таким образом носители нумеруют и помещают в мешочек размером 10x15 см, в котором имеется специальное отделение для максимального термометра. Мешочки размещают в контрольные точки (п. 3.3.2.).
10.2. После проведения испытания индикаторов биологических БИК-ИЛЦ извлекают из мешочков, помещают в полиэтиленовый пакет и с соответствующим направлением доставляют в лабораторию для дальнейшего исследования.
10.3. В бактериологической лаборатории при соблюдении правил асептики проводят исследование. С этой целью индикаторы биологические БИК-ИЛЦ извлекают из упаковки и добавляют (в т.ч. и в контрольные) по 1 мл цветной питательной среды с индикатором бромтимоловым синим, а в пробирки Эппендорфа - по 0,5 мл этой же среды.
Посевы с индикаторами биологическими Staphylococcus aureus и B.cereus инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) град. C в течение 2 суток.
Учет результатов проводят путем ежедневного визуального осмотра. При наличии роста культуры цвет среды в присутствии индикатора меняется с сине - зеленого на желтый. В этом случае делают высев на плотные питательные среды - мясопептонный или желточно - солевой агары - для сопоставления выделенной культуры с контрольной.
10.4. При обнаружении неудовлетворительных результатов бактериологическая лаборатория извещает об этом по телефону руководителя медицинского учреждения и направляет ему заключение о результатах бактериологического контроля.
В случае обнаружения роста хотя бы в одном из посевов индикатора биологического проводят повторный контроль работы камеры. При этом более тщательно проверяют ее техническое состояние, норму загрузки вещей, правильность их размещения в камере.


Приложение N 1
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
1. Пшеничный агар
К 1 кг дробленного пшеничного зерна или пшеничной крупы (Артек, Полтавская) добавить 2 л дистиллированной воды. Через 18-24 ч. настой осторожно слить (не отжимая зерна) и долить дистиллированной водой до 2-х л. Затем добавить 50 г агар - агара, нагреть до полного растворения и завернуть в толстый слой ваты для медленного охлаждения и лучшего выпадения осадка. На следующий день срезать осадок, растопить среду и установить pH = 7,4. После этого среду разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром три дня подряд по 40-60 мин. После стерилизации скашивают.
2. Мясопептонный бульон с индикатором
бромтимоловым синим
К 1000 мл мясопептонного бульона добавить 5 г глюкозы до полного растворения последней, профильтровать раствор через ватно - марлевый фильтр и добавить 2,5 мл 1-процентного спиртового раствора бромтимолового синего. Установить pH = 7,3 +/- 0,1; разлить во флаконы и стерилизовать при 110 град. C в течение 30 мин.
Цвет среды из сине - зеленого при проращивании спор меняется на желтый.
3. Глицериновый бульон (2%)
К 1000 мл мясопептонного бульона pH = 7,2 +/- 0,1 добавить 20 мл глицерина, стерилизовать в течение 3 мин. при температуре 120 град. C.
4. Глицериновый агар (2%)
К 1000 мл мясопептонного бульона pH = 7,2 +/- 0,1 добавить 20 г агар - агара и 20 мл глицерина. Стерилизовать 30 мин. при температуре 120 град. C.
5. Картофельно - глицериновая среда
Сырой картофель (из расчета 200 г очищенного картофеля на 1000 мл водопроводной воды) тщательно вымыть, очистить от кожуры и глазков, нарезать мелкими ломтиками, залить водопроводной водой и кипятить 30 мин. после закипания (молодой картофель употреблять нельзя!). Отвар отстоять и профильтровать в холодном состоянии через ватно - марлевый фильтр. Довести объем фильтрата до 1000 мл и установить pH = 7,2 +/- 0,1. Добавить 5 г пептона и 25 г агара. Нагреть, помешивая, до полного расплавления агара, профильтровать через ватно - марлевый фильтр, после чего добавить 1 г меда и 20 мл глицерина, разлить по флаконам и стерилизовать при 120 град. C в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконах скашивают.
6. Сахарозо - желатиновая среда
К 100 мл дистиллированной воды добавить 1 г желатина и 5 г сахарозы. Дать постоять среде 2 ч. при комнатной температуре. Затем стерилизуют в автоклаве при 120 град. C в течение 30 мин.


Приложение N 2
Московский городской
центр дезинфекции
Испытательный лабораторный В Центр санэпиднадзора
центр (дезстанцию)
N ____ ______________________
_______________ 200_ г.
При этом прилагаются индикаторы биологические БИК-ИЛЦ в
количестве __________ за NN_______________ для проведения контроля
дезкамеры _______________________.
"__" ____________ 200_ г. Зав. лабораторией
____________________
В испытательный лабораторный центр
Возвращаются индикаторы биологические БИК-ИЛЦ за NN_______________
для проведения контроля дезкамеры системы ________________________
принадлежащий ____________________________________________________
находящийся по адресу: ___________________________________________

Медицинское законодательство »